编码dna结合蛋白的cdna克隆的检测、纯化和鉴定

《编码dna结合蛋白的cdna克隆的检测、纯化和鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测.纯化和鉴定本节介绍一种应用纯化的DNA识别位点探针(DNArecognition-siteprobe)从一适宜的由入gtll表达型载体构建的cDNA文库屮筛选编码特异性DNA结合蛋白的重组体克隆的方法。其基本原理是利用该标记探针能与相应的DNA结合蛋白相结合的性质。只有一个部位与DNA结合蛋口结合的探针叫单位点识别探针，若有多个部位与蛋白结合，则为多位点识别探针。该法的最大优点是避免了利用纯化DNA蛋白去筛选相应cDNA重组体克隆的繁杂过程。一、用位点识别DNA筛

2、选Xgtll表达文库该筛选方法成功的关键在于所用DNA文库和识别位点探针的质量。重组cDNA文库最好由随机引物和多位点识别探针去筛选。筛选前应测试合成的探针能否被所需蛋白所结合。在可能情况下，应选择一组相关位点中亲和力最强的一些位点组成多位点探针，采用这种探针可以提高筛选效果。(一)试剂与药品PUC重组质粒DNA(含有多串联拷贝的野生型或突变型识别位点)。lmol/LTris•HCl(pH7.5);在800ml蒸憾水中溶解121gTris碱浓HC1调pH至7.5加水定容至lLodCTP、dGTP>dTT

3、P、dATP各5mmol/L[a-32P]dATP500Ci/mmol大肠杆菌DNA聚合酶I的klenow片段500mmol/LEDTA(pH8.0)苯酚/氯仿/异戊瞰25：24：1)氯仿/异戊醇(24:1)3mol/L乙酸钠(pH5.2)：将408gNaAc•3H2O溶于H2O中用3mol/LHAC调pH至5.2加水定容至1升无水乙醇加样缓冲液：20mmol/LTris•HCl(pH7.5)200mmol/LNaCl1mmol/LEDTA室温下贮存大肠杆菌菌株Y1090入gtllcDNA文库含0.2%

4、麦芽糖和50Pg/ml氨节青霉素的LB培养基。0.7%顶层琼脂糖，熔化并恒温于47°C含50ug/ml氨节青霉素的LB培养基铺于直径为100mm和150mm平皿上，干燥并预热至37°Co10mmol/LIPTG（用无菌水制备lmol/L母液贮存于-20°C）BLOTTO：5%脱脂奶粉50mmol/LTris•HCl（pH7.5）50mmol/LNaCl1mmol/LEDTAlmmol/LDTT4°C贮存1〜2周（将奶粉彻底溶解在含有其它成分的无菌水中）结合缓冲液：lOmmol/LTris•HCl（pH7

5、.5）50mmol/LNaCl1mmol/LEDTA5mmol/LDTTlmg/ml超声波处理（〜lkb）小牛胸腺DNA,100°C变性10分钟。氯仿Elutip-d柱（S•S公司产品）直径132mm和82mm硝酸纤维素膜（SS公司产品）（二）基本操作1.在100111适当限制酶缓冲液中用EWRI和Hindlll两种限制酶消化20ugPUC重组质粒。2•加入下列成分：lmol/LTris•HCl(pH7.5),终浓度50mmol/L5mmol/LdCTP>dGTP、dTTP,终浓度lOOumol/L20

6、0piCi[a-32P]dATP(5000Ci/mmol)10单位大肠杆菌聚合酶I.Klenow片段室温反应30分钟，加预冷dATP至终浓度100Umol/L,继续反应30分钟。3•加EDTA至终浓度20mmol/L,依次用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1V/V)和氯仿/异戊醇(24:1V/V)提取。4.加乙酸钠至0.3mol/L,无水乙醇沉淀，将沉淀重悬于200ul水中，加22u13mol/L乙酸钠(pH5.2),再用无水乙醇沉淀。5•用0.75mm宽,5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离标记片段。6

7、.放射口显影，切下包含结合位点DNA的凝胶块，置1.5ml洗脱缓冲液屮，4°C摇床洗脱过夜。7.Elutip-d柱层析，从上清液中纯化标记片段，测定探针的放射性计数并贮存于4°C。上述反应条件下制备的探针其比活性町达2~4X107cpm/pmolo足够用于筛选20张大的印迹膜。8•大肠杆菌Y1090在含有麦芽糖和氨茉青霉素的LB培养基屮37°C培养过夜。取0.5mlY1090菌液与入gt11文库稀释液(含3-4X104ptu噬菌体)在试管中混合，37°C反应15分钟。9•每管加9ml顶层琼脂糖，混匀，铺

8、于37°C预热的含适量氨节青霉素的150mmLB平皿上，平皿置42°C温育3小时左右，直到可见小的噬菌斑，再将平皿移至37°C温箱中。10.将经过IPTG处理的干滤膜平铺于每个平」IIL表面，使其直接与噬菌斑接触，37°C继续培养6小时。（IPTG滤膜的制备方法：干净的硝酸纤维素滤膜浸泡于lOmmol/LIPTG溶液中30分钟，室温空气干燥60分钟）。11.平皿置4°C冷却10分钟，滤膜用针扎孔以作标记。取岀滤膜浸泡于盛有BLOTTO液的平