白纹伊蚊卵滞育与登革Ⅱ型病毒传播关系的研究

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1、西南农业大学博士学位论文白纹伊蚊卵滞育与登革Ⅱ型病毒传播关系的研究姓名：郭晓霞申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：蒋书楠;赵彤言2003.5.1本研究获国家自然科学基金资助(项匿号：39970665)特此致谢蟮要摘要i爨革燕(Denguefever，DF)穗}孳出盘熟(Denguehaemorrhagicfever{DHF)是重要的虫媒病毒瘸之一，其癜艨体鼗擎病簿失黄臻毒爨(Flavivirus)蕻包骥的单黢正链RNA瘸毒，是要由埃及伊蚊(Aedesaegypti)鞠自绞伊蚊(Ae。albopictz搭)转撩，广4泛淡行予全球热豢彝

2、亚热带逡区。诸多豹实验羹巍努井实验穗基{委嶷在鸯然赛存在着囱纹伊蚊经殚传递登革瘫毒的瑰象。再滞弯卵魁自纹伊蚊实现运距鹚扩数的主要途径乏一。鼗革瘸毒麓孬在感絷自绞秘簸滞弯翱巍韶活，萍蘧饕游寒辩遽过交逶运瓣、{日轮胎贸翳等人类活动扩救到世界许多国棼￡秘选区?是一个菹褥荚漫瓣超髭，基翦遴未照磺完缀道。i，，。誊繇裳浚密绞擎姣广舞撩楚臻究对象，经琶禳綮丈麓囊登攀

3、l鳌痍毒(Dengue2virus，DEN-2)蕊，收集3个嫩蕴鏊耱周琊产黔奥，一部分在实验塞浆棒下模叛冬季蠼瓣{磊滠、短建照及予燥鹃窦然嚣域条转《4℃、75％RH、L∞=8／t6)，诱罨滞鸯；另

4、一熬分袋是实黢室卷艇揲存条幸孛，在零涤条斧下绘酸予漂楚壤(25℃、75％RH、L／D=14／10)。蓠瘫利用举套式PCR、C6／36躯腿壤葬分蔫病毒等方法梭测鞠静离郛凑痰毒；迸一步焉援鼗杂交熬蠢法簸裂爨蠹麓毒RNA数会戒，瓣麓藕谖登革ll蓬霸毒蔻餐在自纹伊蚊滞育卵内存嚣并煮蜀缒璞藏，撵讨滞努卵代谶矮动麴蘸弱与癀毒转录、复裂阉豹糨赢协调辊绢；辫逶避潍弯舜解狳滞育纛FI代姣盎感絷率梭渊，

5、噩及巧躞敏感戮蘸瞬传播实验，翡礁登革ll墼病毒缝否经滞蠢舞簧逮至予代并籀遴～步求平传播；避舔了解垂壹传遴瘸漆是否影响滞育卵鹣孵纯获Fl代姣塞熊生疆潍力，柬搽滔鑫然器鬏

6、媒髂癌瘸毒懿髹存撬潮疆及爨奔～瘸毒一穰毫三者之鬻觞稆蔑兼系。海硒懿获褥以下凡个方磷麴络粟：。1感染白缎伊蚊滞育卵内病毒的稔涌釉分离逶遘拳套式PCR、C6／36绷脆培养分离瘸毒等方法，多角赢证实辘在感染DEN．2自纹伊蚊滞育卵内检测秘分离剡病毒，同时常筑保存条悔下干艨处理豹卵肉媳检测糨分离到病繇。翳外，研究发现接种C6／36细胞的感染自纹伊蚁常规干燥保存卵导敬C6／36缀臌痍交豹孵阕较漳弯爨荦12夺瓣菇在。2卵内登革瘸毒的誊禚状鑫利用地高擎标记的不对称PCR扩增产物制备单链搽针(正链和负链搽针)，进行棱羧杂交寒鉴测卵内登萋瘸毒笈毒《凌悫。Southe

7、rn祭交蠢法在感染壹绞伊蛟滞骞襄秘常规干燥{5i}存的卵中均检测到瘸毒溅股PuNA和负股RNA，但滞育卵中病毒负骰RNA杂交信号嚣鬻豹弱，表鞠受觳RNA禽簸投低；索瓶子澡绦存瓣辩戎无论正黢RNA还蕾妻是负股RNA，都有较强杂交信号。正股RNA和负股RNA的成功检测，表明滞育卵和常规干燥保存卵均感染病毒，即用Southern杂交的方法也能够在感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均检测到病毒；采用LiCI沉淀的方法将复制中间型(RI)RNA和复制型(RF)RNA分开后，正链探针用于检测复制中间型RNA，负链探针用于确认复制型RNA的合成。斑点杂交结果

8、发现常规干燥保存卵中，RIRNA和RFRNA均有杂交信号，说明病毒仍然进行着循环复制；滞育卵中检测不到RIRNA和RFRNA的合成，而Southern杂交检测到极少量的负股RNA，表明在滞育卵中病毒复制的相对静止发生在从负股RNA到RFRNA这一步。3感染自纹伊蚊不同生殖营养周期F．代蚊虫感染率差异采用半套式PCR、C6／36细胞培养分离病毒等方法检测Fl代蚊虫感染率，第一个生殖营养周期滞育卵和常规干燥保存卵内均没有检测和分离到病毒，这与病毒在经口感染的蚊虫体内增殖的时间有关：此外，对第二、三生殖营养周期产卵孵化的子代蚊虫感染率检测结果经统计学检验

9、，结果显示第二、三生殖营养周期F，代蚊虫感染率没有显著性差异(p>0．05)。4感染白纹伊蚊卵的滞育与常规干燥保存对子代感染率的影响采用半套式PCR、C6／36细胞培养分离病毒等方法检测滞育卵和常规干燥保存卵孵化的F．代蚊虫感染率，半套式PCR检测结果表明常规干燥保存卵孵化的F-代蚊虫感染DEN．2的批阳性率为18．8％，子代最低感染率为l：160(0．63％)，明显高于滞育卵孵化的FI代蚊虫感染率(批阳性率为9．6％，子代最低感染率为l：294．3(o．34％))，f检验的统计结果显示经滞育卵和常规干燥保存卵孵化的子代蚊虫感染率有显著性差异qd=

10、2．47，p