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1、广州市海珠区白纹伊蚊体内登革病毒的检测研究?l970?广州市海蔡金生姚振江JournalofQiqiharUniversityofMedicine,2011,Vot.32,No.12珠区白纹伊蚊体内登革病毒的检测研究【摘要】目的观察广州市海珠区登革热传播媒介白纹伊蚊携带登革病毒的情况,为做好登革热病毒监测和预防工作提供政策依据.方法收集海珠区15个村及旧疫点捕获白纹伊蚊成虫和幼虫(实验室培育羽化成成蚊),提取登革病毒RNA,OmestepSYBRGreenI实时RT—PCR进行检测.结果2008年4月
2、～2010年1O月从广州市海珠区采集的679批白纹伊蚊(8495只)中,共检测出3份阳性结果,分别来自登革热疫点和旧疫点,经测序证实为登革I型,其余为阴性.最低感染率为0.34.结论本研究白纹伊蚊携带登革病毒比率较低,可能与登革病毒在蚊体内传代的递减效应,采样时间滞后以及广州登革热非连续性爆发有关【关键词】白纹伊蚊登革病毒荧光定量PCR登革病毒(DengueVirus)是登革热(Denguefever,DF)的病原体,广泛流行于热带,亚热带地区,是一种经伊蚊传播的急性病毒性传染病,为《中华人民共和国传
3、染病防治法》规定的乙类传染病_1].我国南方各省多处亚热带地区,夏季多雨,气候温暖潮湿,自然环境非常适合登革热等蚊媒传染病的传播近年来,我国广东等省均有此病的流行.其流行特点是先为散发输入性病例,后为流行期;先城市后农村;发病呈上升趋势,给人们的身体健康造成极大威胁].白纹伊蚊作为广州地区登革热的主要传播媒介,其分布,密度及带毒率与登革热的爆发流行有密切关系,对白纹伊蚊进行有效的监测和控制是预防登革热爆发流行的主要手段L3].我院从2008年开始对广州市海珠区15个村进行了白纹伊蚊体内登革病毒的检测,
4、为做好登革热病毒监测和预防工作提供政策依据.1资料与方法1.1实验虫源从广州市海珠区15个村及旧疫点捕获的白纹伊蚊成虫和幼虫,幼虫在实验室培育羽化成成蚊.1.2登革病毒实验用登革I型病毒(广州株),由广东省疾控中心病毒免疫科提供.1.3主要实验试剂TRlzol试剂购于Invitrogen公司,one—stepSYBRRT—PCRkit(perfectrealtime)试剂盒购于TaKaRa公司.1.4病毒检测用引物上游引物:5一CTTTCCTCTTTCcTGcTTGcTAAC下游引物:5一ATCCGT
5、GACCATGCTCCTTATG3作者单位:广东药学院附属第二医院(新海医院),广州(蔡金生)广东药学院公共卫生学院,广州(姚振江)邮编510300收稿13期2011--05—111.5病毒RNA的提取参照文献口]介绍的方法,将白纹伊蚊置于研磨杯中,加入1mlTRIzol试剂研磨后室温静置;加入200l氯仿,剧烈振荡后静置5min,13000r/min离心10min,吸取上层水相转移至另一离心管;加入等体积异丙醇混匀,置一2O℃冷冻10min,离心,去上清;用75乙醇洗涤,真空干燥后溶解于20l去RN
6、ase水中.1.6实时荧光定量PCR检测登革病毒核酸登革病毒通用和分型引物,探针由广东省疾病预防控制中心病毒所提供,RNA提取用罗氏公司HighPureviralRNAKit试剂盒,反应体系用某生物工程有限公司TaKaRa试剂盒;RNA提取按照HighPureViralRNAKit试剂盒说明书,制备模板RNA;反应体系配制:2×OneStepRT—PCRBuffer11I12.5"l,TaK—aRaExTapTMHS0.5tt,lPrimescriptTMRT混合酶Ⅱ0.5l,上游引物0.6l,下游引
7、物0.61,探针0.3l,双蒸水5"l,RNA模板5ttl;反应条件为42℃30rain,95℃2min后,进行4O个循环的二步法PCR:95℃5s一55℃35s,荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行;结果判断以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,以本底信号标准差的1O倍作为荧光阈值Ct<35的标本判断为相应的登革病毒核酸检测阳性.1.7测序将判断为PCR阳性的样品由TaKaRa公司测序.2结果采集的679批自纹伊蚊(8495)中,检测出3份阳性标本分布在3个村,经
8、测序证实为登革I型,评价标准:批阳性数阳性批数/总批数;最低感染率(MIR)一阳性批数/总只数X1000一.见表1.参考文献[1]KantGJ,LenocRH.Comparisonofstressresponseinmaleandfemalerats:pituitarycyclicampplasmaprolactin,growthhor—moneandcorticosterone[J].Psychoneur0endocrin0logy,1983,421—
