缺失型α--地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制

《缺失型α--地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、南方医科大学201l级硕士学位论文缺失型0【．地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制Developmentofdeletional0c—thalassemiagenecopynumberquantificationtestkit课题来源：国家重点技术研究发展项目(2012BAl09801)广州市科技计划项目(2010J．E451)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员王格徐湘民教授遗传学学术型硕士研究生基础医学院康铁邦教授张镇海教授赵存友教授韦相才教授赵虎教授201

2、4年04月22日广州卿硕士学位论文一缺失型仅．地中海贫血基因拷贝数定量检测试剂盒的研制硕士研究生：王格指导教师：徐湘民教授摘要研究背景与目的地中海贫血(thalassemia，简称地贫)是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺如，使形成血红蛋白的0【．链／非c【．链比例失衡，而导致的一组严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区，保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人，其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。地中海贫血主要包括0【．地中海贫

3、血和p．地中海贫血，在广西、广东，a．地中海贫血基因的人群携带率分别高达17．55％、8．53％。此病目前缺乏有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。伍．地中海贫血属于常染色体隐性遗传病，其分子基础是位于16号染色体末端16p13．3位点上的人a珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷。导致0【．链合成减少的基因缺陷主要(>95％)是0【珠蛋白基因缺失，其缺失数目是01．地中海贫血临床表现及分型的依据。在我国南方地区常见的三种0【．地中海贫血缺失基因型为．．8EA

4、／0101(东南亚型)、．0137／a01(右缺失型)、．0142／01a(左缺失型)。目前对于a．地中海贫血的筛查仅停留在血液学指标，即只有明显的血液学表型的个体才会进行进一步的分子诊断，这会导致大部分的静止型携带者(如．03．7／0101和．0．42／0101)漏检，所以对于01．地中海贫血的筛查急需一种简单、快速基因分型的筛查手段。然而对于0【．地中海贫血的分子诊断，SouthernBlot杂交技摘要术是金标准，准确性高，但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；目前常规的检测技术

5、是gap．PCR技术，只能定性检测各己知缺失类型，工作量大、检测通量小，并且存在其他缺失类型的假阴性和PCR污染导致的假阳性，故仍不能满足当前大规模人群筛查及常规分子诊断的需要。本课题组发明了一种用基因拷贝数直接定量快速诊断缺失型c‘．地中海贫血的方法(专利号：ZL201110081598．8)，该方法是采用TaqMan实时定量荧光PCR技术直接定量分析HBZ、HBAl和HBA2的相对拷贝数来诊断是否存在缺失，有效避免了由缺失类型遗传异质性导致的假阴性和外源污染导致的假阳性，且易于实现自动化与标准化，提高了

6、检测通量和检测效率，适合缺失型cc．地中海贫血大规模人群筛查和常规分子诊断。本研究是以该发明专利为技术基础，通过全基因组DNA提取的研制和PCR扩增检测体系的建立，研制出可用于临床常规检测应用的试剂盒，以满足当前临床检测的需要。研究方案与方法一个分子诊断方法，涉及到样本来源、样本制备、样本检测、结果分析等步骤，只有做好每个步骤的质量控制，才能保证结果的准确可靠，所以，基于这种完整的诊断流程，本研究具体实施了以下研究方案与方法。1．样本采集、运送及保存。不同的抗凝剂对PCR扩增的影响是不同的，例如肝素抗凝的血

7、液标本经DNA提取后仍会影响PCR的扩增效率。血液的新鲜程度也会影响DNA提取的质量。故本研究所采用的血液标本均要求为EDTA或枸橼酸钠抗凝全血，存放在4。C冰箱不超过7天，在．20+5℃保存期为6个月；若要长期保存，需储存于．80土5℃；标本应避免反复冻融。2．全血基因组DNA提取。人类基因组DNA样本的浓度和纯度对PCR扩增都具有较大的影响，例如人类基因组DNA样本浓度太低(低于最低检测限)或含有PCR抑制剂会导致PCR扩增受到影响。因此本研究从红细胞裂解液、变性剂、消化时间、提取液和DNA溶解液等方面

8、对DNA提取方法进行全面的研制，II硕士学位论文研制出一种能满足荧光定量PCR要求的DNA提取方法，并利用紫外分光光度计来监测DNA样本的浓度和纯度。3．试剂盒原料的质量检测。原料质量合格是一个实验成功的基本要求，所以原料的质量检测尤为重要。主要的原料包括蛋白酶K、氯化锂、引物、探针和聚合酶。蛋白酶K应为白色絮状或粉末状；氯化锂应为白色结晶粉末，分析纯；引物和探针应采用紫外分光光度计测定浓度，采用聚丙烯酰胺凝胶电