实时定量PCRGMO检测转基因拷贝数测定.docx

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1、实时定量PCR的GMO检测-转基因拷贝数测定BMCBiotechnology2004,4:14利用实时定量PCR技术估算转基因水稻的转基因拷贝数Litao Yang1,2,Jiayu Ding1,3,Chengmei Zhang4,Junwei Jia4,Haibo Weng4,Wenxuan Liu3andDabing Zhang1,4 摘要在转基因植物中，转基因拷贝数对目标基因的表达水平和遗传稳定性有很大地影响，这使得转基因拷贝数的估算成为转基因作物研究中的重要课题。目前，转基因拷贝数是通过South

2、ern分析来估算的，这种方法费力又费时，需要大量的植物材料，并可能会引入危险的同位素。在本文中，我们报道了一种高灵敏、高通量的实时（RT）－PCR技术，用来估算转基因水稻的转基因拷贝数。本系统使用了TaqMan定量RT－PCR技术，通过与编码蔗糖磷酸合成酶（SPS）的水稻内源参照基因进行比较，来决定转基因水稻中外源葡萄糖苷酸酶（GUS）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因的拷贝数。T0代转基因植物的GUS和HPT拷贝数是通过将GUS和HPT基因的定量PCR结果和内参SPS的结果进行相互比较来计算的。在优化的P

3、CR条件下，我们可以准确地评估含有一个、二个、三个和四个转基因拷贝的T0代转基因植物。另外，在我们对GUS报告基因和HPT选择标记基因的拷贝数估算中，显示出转基因水稻T－DNA重组现象的发生频率比一般认为的更高。关键词转基因水稻，TaqMan实时PCR，GUS，HPT，拷贝数前言从第一个转基因番茄FLAVRSAVR问世以来，转基因技术得到迅猛的发展（FDA1994;KokandKuiper2003），各种外源基因被引入到植物中，改善了它们的特性（Einspanier2001）。在过去七年里，全世界转基因作

4、物的种植面积从1996年的170万公顷增加到2003年的6770万公顷（James2003）。当得到新的转基因植物时，一个重要的步骤是对它们进行分子水平的定性。必须对大量的第一代转化植株进行分析，因为新DNA是被随机地插入到植物基因组中的，而插入到一个或多个染色体位置的多个转基因拷贝经常会导致基因沉默。插入一个或两个外源基因的植物能产生高水平的表达（Flavell1994;Vaucheretetal.1998），所以估算转基因拷贝数是选择和种植转基因植物的关键。转基因拷贝数一般是通过Southern分析来

5、估算的，近年来其他方法也用于拷贝数的估算，包括比较基因组杂交（Larramendyetal.1998）、荧光原位杂交（Kallioniemietal.1996）、多重扩增探针杂交（Armouretal.2000;Holloxetal.2002）和芯片（Lucitoetal.2000;Lietal.2002）技术。但是所有这些方法都费力而且费时，需要相当数量的新鲜或冷冻样品的DNA，而且经常要用到危险的同位素（DePreteretal.2002）。另外，这些方法产生的结果经常不能正确地反映出那些会导致相应限

6、制性酶切位点缺失（Masonetal.2002）的转基因拷贝的重组情况。为了克服这些限制，许多研究者开发了快速、敏感和有效的定量PCR技术来，用于决定转基因植物中的转基因拷贝数，例如通过连续竞争性的定量PCR（Callawayetal.2002）来估算NicotianatabacumNT-1细胞悬液中的转基因拷贝数，以及通过TaqMan实时定量PCR技术来估算转基因番茄和玉米的拷贝数（Inghametal.2001;Masonetal.2002;Songetal.2002）。不过直到现在，还没有人研究过利

7、用RT－PCR技术来估算转基因水稻中的转基因拷贝数。我们在本文中描述了一种定量RT－PCR的分析方法，通过与编码蔗糖磷酸合成酶（SPS）的水稻内源参照基因（Dingetal.2004）进行比较，来快速、准确地估算转基因水稻中的外源β－葡萄糖苷酸酶（GUS）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因拷贝数。材料和方法材料双元质粒pCAMBIA1301（GenBankno.AF234297）包含了CaMV35S启动子控制下的GUS和HPT基因（Robertsetal.1998），将它通过AgrobaCteriumtum

8、efaciens介导转化到水稻种属OryzasativaL.sspJaponica9522中。DNA提取利用DNA提取Kit（ShanghaiRuifengAgro-tech,Shanghai,China）来提取和纯化用于定量RT－PCR分析的水稻基因组DNA样品。根据CTAB方法（Sambrooketal.1989）从新鲜叶子中提取和纯化用于Southernblot分析的水稻基因组DNA样品。基因组DNA通过测量260nm的