重组人cyp3a4大肠杆菌表达系统的建立

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文重组人CYP3A4大肠杆菌表达系统的建立EstablishmentofE．coliexpressionsystemforrecombinanthumanCYP3A4课题来源：中医药管理局(201200097)专业名称药理学学位申请人柳艾姣指导教师赵树进教授答辩委员会主徐江平教授答辩委员会成许重远教授邱健主任医师石磊主任药师袁进副主任药师论文评阅人吴曙光教授蔡绍晖教授2012年5月15日硕士学位论文重组人CYP3A4大肠杆菌表达系统的建立硕士研究生：柳艾姣指导老师：赵树进教授石磊教授刀口荔犀Y何摘要细胞色素酶P450(CYP)是含有血红素的一族单加氧酶，主要

2、参与代谢内源物质(如甾体、胆汁酸、脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、生物源性氨类等)和外源性物质的代谢。细胞色素酶能够催化生物界各种外源物质的氧化代谢，包括药物、植物提取成分或被真菌衍生的食物的次级代谢产物及大量的环境污染物、工业化合物、除草剂和除虫剂等。代谢外源物质的人源细胞色素酶P450的形式有CYPl，CYP2和CYP3家族。这些家族中的个别细胞色素酶P450具有很广泛的和重叠的底物特异性，负责约70．80％目前临床使用药物的代谢。人类细胞色素酶P450在代谢内源性物质和外源性物质包括药物中起重要的作用，因此，新的候选药在临床前开放阶段测试其与细胞色素酶间的相互作用是标准程序。药物和其他

3、外源物质通过诱导或抑制对细胞色素酶活性调节，是药物相互作用的基础。药物的相互作用可以引起严重不良反应，这将导致药物开发的提前终止，拒绝批准上市，严重的处方限制，甚至于从市场上撤回药品。最常见的药物相互作用机制是对细胞色素酶的抑制。在药物开发前期，要常规开展实验来确定前体物质是由哪些细胞色素酶代谢的。此外，前体物质对细胞色素酶的抑制作用可用体外培养的方法来评估。通常，但并非总是，一种化合物能够抑制特定的细胞色素酶P450类型，同时也是这种细胞色素酶P450的底物。中文摘要CYP3A4是人体内重要的细胞色素酶P450之一，占CYPs总量50％。CYP3A4在外源性物质代谢中具有举足轻重的作用，

4、据估计有高达50％以上的临床使用的药物由CYP3A4代谢。CYP3A4能被多种药物诱导和抑制，且具有基因多态性，这是造成药物作用个体差异的最重要因素之一，也是发生药物相互作用的原因之一。CYP3A4的活性部位非常强大和其作用具有弹性，能允许结构非常不同的化合物结合与随后的代谢。大肠杆菌是用于表达人类细胞色素酶P450最常用的宿主。除了具有简单的遗传操作和培养外，大肠杆菌因其本身没有自己的细胞色素酶，成为表达人类细胞色素酶P450的合适宿主。同时，在大肠杆菌中蛋白的产量是非常高的，因此重组细胞色素酶P450在大肠杆菌中的表达水平是在酿酒酵母菌种表达水平的50．100倍。一般来说，人类细胞色素

5、酶P450在大肠杆菌中表达的表达水平，可以从文献中发现，在一个显著的范围内变化。表达水平的不同可以归因于不同表达宿主的使用和遗传策略的实施。在大肠杆菌中表达人类细胞色素酶P450的表达水平关键取决于在培养这些大肠杆菌菌株时的培养条件。1991年，哺乳动物细胞色素酶P450蛋白通过对N．末端氨基酸序列的修饰第一次表达在大肠杆菌细胞中。自此后，为了使重组细胞色素酶P450在大肠杆菌中由功能的表达，各种不同的策略已经建立，包括N．末端序列的修饰，分子伴侣的使用和在低温度下培养。在所以情况下，在大肠杆菌中表达的人类细胞色素酶P450已被证明具有高效地催化氧化代表底物的能力。这些重组的细胞色素酶P4

6、50能够应用于研究，如估计药物的氧化反应动力学参数，也能用于鉴定人类细胞色素酶P450对药物的代谢途径和致癌物质的消除机制。现在可以使用各种不同种类的重组人类细胞色素酶用于各种目的，在制备一个新的候选药物的过程中，确定其代谢酶类已经成为了例行常规。这种方法已被用于体外制定合理的策略来预测相关的生物利用度，毒性和药物问相互作用。目的：比较生理盐水和RNAlater溶液两种处理保存组织方法对提取的总RNA的影响，以得到肝脏组织的比较好的保存方法。Ⅱ硕士学位论文探讨0【．ALA(O．5mM和lmM)、IPTG(0．5mM和lmM)、卡那霉素(50txg／mL和10099／mL)添加浓度及菌的接种

7、密度对重组CYP3A4膜蛋白表达水平的影响，以优化重组CYP3A4在大肠杆菌中表达条件。用含有T7启动子的表达载体pET-28a(+)，构建重人类CYP3A4大肠杆菌表达系统，以用于体外研究药物之间的相互作用，也可以用于新药开发时确定新药的代谢特征及与其他药物间的相互作用。在重组野生型CYP3A4基础上通过定点突变获得变异的CYP3A4，研究CYP3A4各亚型的药物代谢与野生型CYP3A4的差异来指导临床上个体化用药。方