大肠杆菌表达系统-3

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1、第三章真核基因在大肠杆菌中的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第一节基因的表达系统与表达策略最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利

2、用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。一、真核基因的大肠杆菌表达体系目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。大肠杆菌表达体系的优越性：1.对大肠杆菌的背

3、景知识（完成基因组全测序），特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解（乳糖操纵子）；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异

4、，影响真核基因mRNA稳定性。4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。6.大肠杆菌周质内存在各种内毒素。克隆基因正确表达的基本条件能够进行正常的转录和翻译，以及在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。启动子、终止子以及正确读码框（ORF）。二、大肠杆菌的表达载体1、大肠杆菌表达载体的基本成分RBSRPSD编码序列TTtetrOri-35-10ATG（91%）TAA1

5、7TTGACA。。。。。TATAATGTG（8%）TGATTG（1%）TAGTAAGGAGG（N）8RBS：ribosomebindingsite,核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理•启动子转录水平•终止子•核糖体结合位点翻译水平•密码子•质粒拷贝数•寄主生理状态（1）启动子要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：1）必须是一个强启动子。2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。（外源蛋白可能对细胞有害）3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式

6、使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如IPTG）诱导。（2）转录终止子*当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。—启动子封堵作用*在克隆基因编码区的3’-末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。（避免产生多余的二级结构）（3）翻译起始序列mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖体结合位点），是决定mRNA翻译效率的主要因素。至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以

7、用来有效地降低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。例如:在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。（4）翻译增强子大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子。例如：T7噬菌体基因10的前导序列（g10-L）、以大肠杆菌atpE基因为代表的一些mRNA分子5’-UTR中的富含U的区段，以及直接位于T7基因起始密码子下游的“下游元件”等。分子机制不明。（

8、5）翻译终止密码对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其是当连上一个