基因工程3大肠杆菌表达系统

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1、前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第三章真核基因在大肠杆菌中的表达最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度

2、的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。一、真核基因的大肠杆菌表达体系目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。大肠杆

3、菌表达体系的优越性：1.对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序哦），特别是基因表达调控的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信

4、号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。6.大肠杆菌周质内存在各种内毒素。克隆基因正确表达的基本条件最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。启动子、终止子以及正确读码框（ORF）。重要条件：编码的蛋白质产

5、物应能维持正常的稳定性。具有核糖体结合位点；具有强启动子；……二、大肠杆菌的表达载体1、大肠杆菌表达载体的基本成分TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PRTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBS外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录水平翻译水平（1）启动子要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：1）必须是一个强启动子。2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表

6、达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如IPTG）诱导。（2）转录终止子*当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。—启动子封堵作用*在克隆基因编码区的3’-末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。（3）翻译起始序列mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖体结合位点，RBS），是决定m

7、RNA翻译效率的主要因素。至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。例如:在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。（4）翻译增强子大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子。例如：T7噬菌体基因10的前导序列（g10-L）、以大肠杆菌atpE基因

8、为代表的一些mRNA分子5’-UTR中的富含U的区段，以及直接位于T7基因起始密码子下游的“下游元件”等。分子机制不明。（5）翻译终止密码对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其是当连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况