大肠杆菌表达系统.ppt

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1、外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷

2、贝数转录翻译Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAAT启动子转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子lacI启动子Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMP

3、CAPlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在

4、使用时比野生型Plac更易操作。Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用

5、tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATlac、tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。lac、tac启动子对宿主菌的

6、要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。lac、tac表达系统存在的问题IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并

7、不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录lac、tac表达系统存在的问题lac和tac启动子的转录受温度严紧调控把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具