组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制

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1、南方医科大学20ll级硕士学位论文组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制TheEfjfectandMechanismofHistonesonApoptosisofLIymphocytesinSepsisVIV■课题来源：国家自然科学基金(81101451)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员蔡靓常平教授急诊医学专业型硕士研究生第二临床医学院曾红科教授刘继云主任医师郭振辉教授邢锐主任医师寇秋野副教授2014年05月26日广州硕士学位论文组蛋白在脓毒症过程中对淋巴细胞的凋亡作用及机制硕士研究生：蔡靓指导教师：常平，刘占国摘要研究背景脓

2、毒症是指由细菌、真菌或病毒感染所诱发的全身炎症反应，是导致休克及器官功能衰竭的常见原因。脓毒症进展迅速，病死率高，已成为重症医学病区的主要死亡原因。脓毒症因其发生、发展机制复杂，增加了疾病在临床上治疗的困难性。大量研究显示：脓毒症过程中存在大量的免疫细胞及非免疫细胞凋亡，成为免疫抑制及器官损伤的重要因素。其中，不同细胞对凋亡刺激的易感性存在着明显差异，免疫细胞和肠道上皮细胞由于代谢活跃最易发生凋亡。细胞凋亡对免疫系统的后续影响是脓毒症死亡的关键，尤其是免疫细胞，凋亡使免疫细胞的数量明显减少，细胞凋亡后分泌的免疫抑制因子作用于附近的免疫细胞，使具有负性免疫功能的T细胞占据优势，从而

3、固有免疫和获得性免疫能力均受到影响。脓毒症患者外周血中发现的凋亡细胞明显多于非脓毒症对照患者，免疫细胞凋亡介导免疫抑制促使脓毒症病情不断恶化，是脓毒症死亡的关键。在动物实验中，通过阻止或抑制免疫细胞凋亡的治疗已经显示出了一定疗效。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3、H4五种类型，构成核小体的核心，除参与构成染色体结构外还具有异染色质形成、基因印记、x染色体失活和转录调控等多种主要生理功能。在健康人群或病人体内，均可有细胞外组蛋白出现，它们是由濒死的细胞释放。组蛋白由胞内释放到胞外的机制尚不十分明确，若凋亡或坏死的细胞在死亡过程中释放的核小摘要体超

4、过了机体正常清除能力或者机体清除核小体的能力受损，可导致循环中的组蛋白浓度升高。此外，由中性粒细胞分泌的中性粒细胞胞外诱捕网(neu仃opllilextracellular仃aps，NETs)是由DNA、组蛋白和细胞颗粒蛋白构成的复合物，具有病原微生物清除作用，其中发挥作用的关键物质是组蛋白。在脓毒症过程中NETs大量释放，在抗菌的同时也介导了免疫细胞和组织细胞的广泛损伤。已有研究证明细胞外组蛋白的释放是脓毒症死亡的主要致死因素，而免疫细胞凋亡介导的免疫抑制是脓毒症死亡的关键。组蛋白和免疫细胞凋亡之间是否存在因果关系尚不清楚。但大量的研究显示组蛋白可以影响钙离子内流、细胞器损伤等

5、细胞凋亡的关键环节，据此，我们提出假设：脓毒症时，组蛋白作用于免疫细胞，通过线粒体损伤、细胞色素C释放及系列caSpase活化，介导免疫细胞凋亡。该研究进一步阐述了组蛋白介导免疫细胞凋亡的机制，丰富了脓毒症的发病机理，为未来脓毒症的治疗提供新的理论依据。研究目的1．明确脓毒症中是否存在组蛋白释放入血；2．探讨组蛋白是否促进淋巴细胞凋亡及作用强度；3．探讨组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的机制；4．探讨组蛋白抗体能否减轻脓毒症引起的淋巴细胞凋亡。研究方法1．检测脓毒症小鼠模型外周血中组蛋白H4的表达a)动物分组选取雄性C57小鼠18只(8．12周龄)，随机分配至三大组：正常对照组，假手术组(

6、sh锄组)，脓毒症模型组(CLP组)。其中，正常对照组不做任何处理：sh锄组只打开腹腔，找到盲肠后再置入腹腔，关闭腹腔；脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术(CecalLigationaIldPullctuI．e，CLP)。于25℃室温下观察6小时，眼球取血约lmL，至肝素抗凝管，摇匀，分离血浆和淋巴细胞，采用westemblot和流式细胞技术分别检测血浆中组蛋白H4和淋巴细胞凋亡率实验重复三次。II硕士学位论文b)脓毒症模型建立小鼠麻醉后固定，备皮，延腹中线切开皮肤，腹白线切开腹膜，腹腔内找到盲肠，于距盲肠末端1／3处结扎，使用21G针头穿孔，盲肠置回腹腔，关闭腹腔，缝合。将术后小鼠放入

7、室温25℃的环境下观察、麻醉苏醒。c)外周血组蛋白H4检测0．7mL全血离心后留取血浆，稀释5倍，加LoadingBu行er变性、离心，放于．20℃保存。BCA蛋白定量检测各组总蛋白浓度，确定各组总蛋白的上样量，检测各组组蛋白H4的表达量。d)动物淋巴细胞凋亡率检测应用密度梯度分离法分离淋巴细胞，加meXinV-FITC／PI避光染色l0min，流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。2．组蛋白促进淋巴细胞凋亡及其作用强度a)细胞分组淋巴细胞来源于健康志愿者全血，经淋巴细胞细胞分离步骤，培