1.runx2甲基化状态变化对血管平滑肌细胞成骨样分化影响的研究%3b2.vaspin对人成骨细胞凋亡作用机制的研究

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1、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：爿堡兰．日期：兰!=年—妇兰日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手

2、段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。博士学位论文中文摘要中文摘要第一部分Runx2甲基化状态变化对血管平滑肌细胞成骨样分化影响的研究第一章小鼠血管平滑肌细胞定向分化为成骨样细胞的细胞模型的构建目的构建体外定向诱导的小鼠血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)向成骨样细胞分化的细胞模型，为本系列研究奠定基础。方法VSMC使用含lOmMl3一甘油磷酸钠(13-glycerophosphatedisodium，13-GP)的培养基培养，定向诱导原

3、代小鼠VSMC分化为成骨样细胞，在细胞培养的0天、12天分别提取总RNA做逆转录，荧光实时定量PCR检测Runt相关转录因子2(Runt-relatedtranscriptionfactor2，Runx2)、骨钙素(osteocalcin，OC)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)mRNA的表达水平；检测碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性；进行矿化结节染色。分别在细胞培养的0天、3天、8天、12天提取总蛋白做WesternBlot，观察平滑肌细胞标志物平滑肌肌动蛋白a(smoothmusclealpha-actin，SMa-a

4、ctin)及Runx2蛋白的表达情况。结果VSMC经过12天诱导后，p．GP可增强Runx2、OC、0PNmRNA的表达，提高ALP活性，促进矿化结节的形成，增强Runx2T博士学位论文中文摘要蛋白的表达，并抑制SMa．actin蛋白的表达。结论本研究成功构建了小鼠VSMC成骨样分化的细胞模型。13-GP增强成骨细胞表型基因Runx2、OC、OPNmRNA表达；增强Runx2蛋白表达：抑制平滑肌细胞表型标志物SMa．actin蛋白表达。13-GP的诱导作用具有时间依赖性特征。关键词p．甘油磷酸钠，肌细胞，平滑肌，Runt相关转录因子2第二章Runx2甲基化状态变化

5、对血管平滑肌细胞成骨样分化影响的研究目的检测VSMC成骨样分化前后以及5．氮杂．2’．脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine，5-Aza-dC)干预后Runx2基因启动子的甲基化状态，观察5-Aza-dC对VSMC成骨样分化过程中Runx2表达的影响，探讨Runx2甲基化状态影响VSMC成骨样分化过程的机制。方法提取对照组VSMC的DNA，通过亚硫酸氢钠测序，确定Runx2基因启动子的甲基化状态。用MTT法检测5-Aza．dC对VSMC增殖的影响，获得适宜的干预浓度。将小鼠VSMC暴露于含有不同浓度的5-Aza．dC矿化培养基中培养12天，分别抽提V

6、SMC的总RNA和总蛋白，观察Runx2在mRNA及蛋白水平的表达情况；用含相同浓度5-Aza-dC(15ⅢM)的矿化培养基干预VSMC，在细胞培养的0天、3天、8天和12天分别抽提总RNA做逆转录，荧光实时定量PCR观察Runx2mRNA表达情况，WesternBlot观察Runx2在蛋白水平的表达。TT博士学位论文中文摘要分别提取10mM[3-GP诱导12天及15tam5-Aza-dC联合10mMp．GP干预12天VSMC的DNA，通过亚硫酸氢钠测序，确定Runx2基因启动子的甲基化状态。结果对照组VSMC的Runx2基因启动子呈高甲基化状态。20州5-Aza

7、-dC干预VSMC24小时后，细胞密度较对照组显著降低(P

8、基化水平降