葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化作用的影响

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化作用的影响Effectsofpuerarinondifferentiationofhumanperiodontalligamentstemcellsintoosteoblastsinvitro课题来源：广东省中医药局2011263广州市中医药局20122A011035学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院吴琳琳兰泽栋教授口腔临床医学专业型硕士第一临床学院2013年4月l、日广州l嗍删硕士学位论文葛根素对人牙周膜干细胞成骨分化作用的影响硕士研究生：吴琳琳指导老师：

2、兰泽栋教授摘要牙周病引起的牙周组织缺损，是造成人类失牙的主要原因，严重危害了人类的生存健康。防治牙槽骨吸收一直是口腔医学领域的热门课题，已开展的牙周引导组织再生术(guidedtissueregeneration，GTR)、生长因子诱导及釉基质蛋白(enamelmatrixprotein，EMP)的局部应用等治疗方法均取得了前所未有的效果，但尚未达到人类所期望的目标。随着组织工程学理论和技术的飞速发展，为牙周组织再生研究提供了新的思路。2004年Seo等人第一次从人牙周膜组织中分离出了多能干细胞，为牙周膜干细胞(periodontall

3、igamentstemcells，PDLSCs)的存在提供了直接的证据。这些细胞能够表达间充质干细胞的特异性标志——STRO．1干1CDl46，并且高表达腱细胞特异性转录因子Scleraxis。PDLSCs属于成体干细胞(adultstemcells，ASC)，具有ASC的特点，大量研究显示PDLSCsI⋯匕够自我更新并在体、内外适当的诱导条件下分化为成骨细胞、成牙骨质样细胞以及脂肪细胞，PDLSCs的多向分化潜能和牙周高相关性使其成为牙周组织工程理想的种子细胞。牙周再生治疗的另一关键因素为促干细胞定向诱导分化的药物，目前研究已证实骨形

4、态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)、EMP、转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)、血小板衍生因子(platelet．derivedendothelialgrowthfactor，PDGF)、雌激素等具有明确的骨向诱导作用。其中雌摘要激素替代疗法已在临床广泛应用，但是长期使用雌激素会极大地提高乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病率。而植物类雌激素葛根素有效地弥补了这一缺陷，它能够发挥雌激素样作用如促进骨密度增加和骨矿沉积。葛根素的英文名为puerarin，化学名为8．1

5、3．D一葡萄吡喃糖．4，7．二羟基异黄酮，在4位和7位各有一个羟基，这两个羟基与雌激素活性密切相关，其中4位羟基是与雌激素受体(estrogenreceptor，ER)相结合的部位。近年来，国内越来越多的学者开始探索葛根素在骨代谢方面的作用：蔡花等研究表明葛根素对脐带间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)增殖及成骨分化有促进作用；李斌斌等将葛根素分别作用于成骨细胞和破骨细胞发现葛根素通过抑制骨吸收刺激骨形成来调控骨代谢，其中抑制骨吸收的效果较强；金为旭将葛根素注射于拔牙窝周围发现其能够抑制剩余牙槽嵴的吸收并保

6、存牙槽嵴的高度；郑高利等研究了葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨矿密度和骨强度的影响，发现去卵巢大鼠口服葛根异黄酮后，全身骨矿含量、骨矿密度和骨生物力学强度均有不同程度的改善，认为葛根异黄酮对去卵巢引起的大鼠骨质疏松症具有明显的防治作用，雌激素样作用是其主要作用机理。虽然已明确葛根素对多种成骨前体细胞具有骨性诱导作用，但关于葛根素对人牙周膜干细胞(humanperiodontalligamentstemcells，hPDLSCs)成骨分化的调控作用尚未见报道。因此，本实验拟探讨葛根素对hPDLSCs的成骨分化的影响，为其应用于临床防治牙槽骨吸收以

7、及组织再生工程奠定理论基础。第一章hPDLSCs的分离培养和鉴定目的：体外分离、培养hPDLSCs，并进行鉴定。方法：1．分离、培养hPDLSCs在供者知情同意的前提下，收集12～16岁因正畸拔除的双尖牙，所选牙齿均无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。将新鲜拔除的牙齿在超净工作台内冲洗干净后，仔细刮取根中1／3的牙周膜组织收集于离心管中，加入1IIll浓度为6mg／ml的胶原酶和1ml浓度为8mg／ml的Dispase硕士学位论文酶(此为四颗牙用量)，混匀后于37。C水浴中消化1h左右，1000rpm离心5min后弃上清，细胞重悬于含10％胎牛

8、血清的c【．MEM培养基中，置于37。C、5％C02培养箱中培养。待人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcells，hPDLCs)传至第三代，采用免疫磁珠法分离hPDLSCs：将约