应用重组msg1蛋白检测猪附红细胞体抗体的elisa方法的建立及其单克隆抗体的制备

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1、山东农业大学硕士学位论文应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备姓名：刘永夏申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：刘建柱20120615山东农业大学硕士学位论文摘要猪附红细胞体(Mycoplasmasuis，M．suis)是一种寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓中的微生物，能够引起猪的发热、贫血、黄疸等临床症状的人畜共患性传染病。鉴于临床猪附红细胞体病造成的巨大的经济损失，对于猪附红细胞体研究成果向实践转化的需求显得尤为迫切。其中对MSGl蛋白的研究相对较多，将其作为研究对象较为合适，于是确定了本

2、课题研究思路。采用人工构建的重组大肠杆菌进行MSGl蛋白的体外表达，对蛋白在大肠杆菌BL21菌株的表达情况进行了初步分析：随后将此蛋白作为检测抗原建立ELISA方法进行临床猪附红细胞体病的检测，并设立了敏感性试验、特异性试验、符合性试验和重复性试验，对建立的ELISA方法进行有效性评估；最后将MSGl蛋白接种小鼠，建立杂交瘤细胞系，筛选阳性克隆，获取单克隆细胞株，进行单克隆抗体的生产。通过试验，发现猪附红细胞体MSGl蛋白在BL21菌株表达系统能以包涵体的形式进行大量表达，并且获得了纯化MSGl蛋白；MSGl蛋白有良好的抗原性，以MSGl蛋

3、白建立的ELISA方法用于临床检测猪附红细胞体病感染率为46．25％，其中阳性样本对己知小鼠抗血清有明显的阻断作用，并且与其他一些抗原无交叉反应，此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97．06％和95．92％，较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率；通过建立的杂交瘤技术，获得了两株能稳定分泌抗体的单克隆细胞系。本试验的成果为进一步研究MSGl蛋白奠定了基础，为猪附红细胞体病的诊断提供了方法和手段，为进一步建立更快、更直观、更简便的检测方法提供了物质基础和依据。关键词：猪附红细胞体；MSGl；表达；ELISA：单克隆抗体应用重组MSGI

4、蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备AbstractMycoplasmasuis∽suis)infectionwasamicro-organismwhichparasitizesonthesurfaceofredbloodcellsandcausesanemia，jaundiceandfeverinswine．Duetothelargeeconomiclosses膨suisinfectionbringingtoUS．thedemandisurgenttotransformtheresearchachieveme

5、ntintopractice．ThereforethethreadofmyresearchWasdeterminedwitlltakingMSG1proteinasthesuitableobjectwhichhadbeenreasearchedmorerelatively．TheMSGlproteinwasexpressedinrecombinantEcolistrain，theexpressedconditionofMSGIWasanalysed．ThenanELISAmethodwasbuilttodetectM．suisinclini

6、calsamplesbasedontheMSG1antigen．Meanwhile，thesensitivity，specificity，coincidenceandrepeatabilityweresettedtoassesstheELISAmethod．Atlast，theMSGlproteinwasvaccinatedintomice，andthehybridomacellswereobtained．Throughscreeningofthepositiveclones，themonoclonalcellswereacquiredto

7、producethemonoclonalantibodiesagainstMSG1protein．ThisexperimentshowedthatMSGlproteincouldexpressedabundantlyinformofinclusionbodiesinEcoliBL21strains，andpurifiedsubsequently．TheantigenicityofMSG1wasadmirable．TheELISAmethodwebuiltWaseffectivetodetectM．suisinclinicalsamplesw

8、ithainfectionrateof46．25％，andthepositivesamplesofthemCanhinderthepolyclonalantibodyfromin