基于pedv s重组蛋白间接elisa抗体检测方法的建立与单克隆抗体的制备

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1、分类号：墨墨5墨：2墨密级：公珏单位代码：!QQ墨互学号：2Q!鳢21基于PEDVS重组蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与单克隆抗体的制备EstablishmentofindirectELISAfordetectingmethodandpreparationofmonoclonalantibodyofPEDVSl‘·orecombinantprotein学位申请人：王晨枫指导教师：范京惠副教授左玉柱副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一三年六月一日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研

2、究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i垦盎些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：辛耘机签字日期：洄刁年()月1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑韭壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑皇垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用

3、影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：办影机导师签名：菇东南签字日期：渺I≥年毛月1日签字日期：汕Jj年6月／日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：嬲摘要猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的，以猪呕吐、严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪死亡率达95％以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的

4、趋势，危害严重，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，PED的及时确诊和防治研究具有重要的意义。根据GenBank中已经发表的猪流行性腹泻病毒毒株的s基因序列并参照PMDl9．T载体图谱，设计了l对分别插入限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点的引物，采用PCR技术从猪流行性腹泻病毒HB／FN株中扩增得到一条1080bp的s基因片段。将其连入pMDl9．T载体中，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经酶切鉴定筛选出阳性克隆后进行测序，测序结果和GenBank上发表的S基因的核苷酸序列根据抗原性分析选择其抗原性较高的s基因片段，设计特异性引物，经PCR扩增得到

5、655bp的基因片段，将此基因片段亚克隆插入到原核表达载体pET一28“+)中，构建了原核表达质粒pET．28“+)．SFN，将重组质粒转化到表达菌株E．coliBL21(DE3)中，经IPTG诱导后用SDS—PAGE分析，结果显示S重组蛋白的分子质量约为25ku，与预计的蛋白分子量一致。利用His标签的特性对S重组蛋白进行纯化，SDS．PAGE分析显示纯化效果好，无杂带。Western-blot试验证明，纯化的s重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性结合反应，证明该蛋白抗原性好。利用纯化的s重组蛋白作为包被抗原，通过各步反应条件的优化，最终确定了检测

6、PEDV抗体的重组S蛋白间接ELISA方法最佳反应条件：抗原经4‘C包被过夜：用封闭液(含5％新生牛血清的PBST)37℃封闭1h；待检血清(用封闭液做1：100倍稀释)100uL于37℃反应1h；酶标二抗(用封闭液做l：1000倍稀释)100laL于37℃反应45min；加入底物后避光显色15min；加入终止液50uL后测定OIM50nm。该方法与TGEV、CSFV、PRV、PRRSV等阳性血清不发生交叉反应，重复性试验结果显示，变异系数均值都小于lO％，表明本方法具有较好的特异性和重复性。用纯化的PEDV重组HIS标签s蛋白做为免疫原，按常规方法免疫

7、BALB／c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备单克隆抗体(MeAb)。经细胞融合获得l株可稳定分泌特异性McAb的抗PEDVS蛋白的杂交瘤细胞，命名为1F2。杂交瘤上清与s蛋白抗原包被的ELISA反应为阳性。Westernblotting试验证明，1F2可以与PEDVS蛋白产生特异性反应，为胶体金免疫层析试纸条的制备奠定了物质基础。关键词：PEDV；S基因；原核表达：ELISA；单克隆抗体EstablishmentofindirectELISAfordetectingmethodandpreparationofmonoclonalantibodyofPE

8、DVSrecombinantproteinAbstractCandidate：W