野生型人tdp-43转基因小鼠和野生型人tdp-43突变型人syn双转基因小鼠的建立及表型分析

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1、中南大学博士学位论文野生型人TDP--43转基因小鼠和野生型人TDP--43/突变型人SYN双转基因小鼠的建立及表型分析姓名：田田申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：刘运海20120526博士学位论文中文摘要摘要研究背景：额颞叶变。I生(FTLD，Frontotemporallobardegeneration)是一种发生于老年前期的痴呆综合征，主要表现为人格改变、社会行为异常及语言功能障碍。肌萎缩侧索硬化(ALS，Amyotrophiclateralsclerosis)是一种以脑和脊髓的运动神经元进行性变性为特征的神经肌肉疾病。FTLD和ALS的病

2、理学特征都表现为受损区域的神经元胞浆和胞核内有泛素化的包涵体，这种包涵体的主要组成成份是反式激活一反应性DNA结合蛋白．43(TDP．43，TARDNAbindingprotein．43)。TDP．43是一种广泛表达的核蛋白，由1号染色体上的TARDBP基因(刚肋B尸)编码。研究发现，在少数的家族性和散发性ALS、ALS合并FTLD的患者中存在TARDBP突变，而大部分存在TDP一43病理的ALS、FTLD．TDP患者中却并无TARDBP突变，并且有Z4RDBP突变和无TARDBP突变的ALS患者之间比较，两者的TDP．43病理并无区别，这说明野生型人T

3、DP一43(WThTDP．43，wild．typehumanTDP一43)也可能导致神经毒性，并且可能在这些神经变性疾病的发病机制中起一定的作用。然而，TDP．43的生理功能及致病机制迄今为止尚未完全明确。本课题由美国国立卫生研究所／国立神经疾病和脑卒中研究所(NIH，NationalInstitutesofHealth／NationalInstituteofNeurologicalDisordersandStroke)(NS064042andNS072113)以及国立卫生研究所／国立环境卫生科学研究所(NIH／NationalInstituteofEm

4、’ironmentalHealthSciences)(ES016760)基金资助博士学位论文中文摘要作为散发性ALS和FTLD的病理学标志，TDP．43蛋白也见于其他的神经变性疾病，如帕金森病(PD，Parkinson’Sdisease)及其他fl,勺*F1关疾病中。PD是以中脑黑质多巴胺神经元进行性丢失为特征的神经退行性疾病。人0【．突触核蛋白(hSY-N，humanalpha．synuclein)基因是PDfl'9致病基因，含突变型人SYN(MUThSYN，mutanthSYN)基因的过度表达可以导致MUThSYN转基因小鼠中脑黑质多巴胺神经元的死亡

5、。由于在PD及其相关疾病患者的组织中也发现有TDP．43包涵体的存在，而且目前认为，神经变性疾病的发病机制有多种因素的参与，因此我们推测TDP一43也可能在多巴胺神经元丢失的机制中起一定的作用。目的：1．明确在遗传上可控的动物模型中，WThTDP一43的表达是否可以导致神经毒性。2．验证我们的假说：TDP．43是否可以增加SYN对多巴胺神经元的毒性。方法：第一部分构建WThTDP．43转基因小鼠模型，通过TDP．43基因PCR扩增以及免疫印迹对其进行鉴定，通过常规观察监测其疾病表型，通过旋转试验进行行为学测定。若400天之后仍未见WThTDP一43小鼠有

6、明显的疾病表现型，则取其脑、脊髓和骨骼肌，进行ALS及FTLD相关的神经病理学分析。同龄的非转基因小鼠(NT’nontransgenicmice)作为对照组做同样处理。神经病理学分析方法包括免疫组织化学染色、组织化学染色、双标记免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、焦油紫染色以及前额叶皮质和海马齿状回神经元的立体计数。第二部分双突变的MUThSYN转基因小鼠由Dr．Richfield赠送。博士学位论文中文摘要我们将WThTDP．43小鼠和双突变的MUThSYN小鼠进行交配，并通过PCR分析进行基因分型，获得WThTDP．43／MUThSYN双转基因小鼠。通过对这些

7、小鼠进行常规观察和行为学测定，分析疾病表型。若观察至200天之后WThTDP．43／MUThSYN小鼠仍未见明显的疾病表型，则对其进行中脑的神经病理学分析。同龄的NT作为对照组做同样处理。分析方法包括免疫组织化学染色、双标记免疫荧光染色和中脑黑质致密部的多巴胺神经元立体计数。结果：第一部分(1)PCR和Westernbolt的结果显示，在wThTDP一43转基因小鼠中有WThTDP一43的表达，而在NT中未见相应表达。(2、)在WThTDP．43小鼠的大脑、脊髓及骨骼肌中均可见hTDP．43的大量表达，并且其主要位于核内，而NT的相应组织中未见表达。在W

8、ThTDP一43小鼠脊髓前角细胞的胞浆内偶可见hTDP一43分布，但未见明显的h