浅议突变型和野生型tnf

《浅议突变型和野生型tnf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、浅议突变型和野生型TNF【,肿瘤Apoptosisoftumorcellsinducedbymutantandanmutanttype471rhTNFα(mt471rhTNFα)echanisminducedbymt471rhTNFα.METHODS:TheapoptosisofZR751cells,abreastcancercellline,inducedbymt471rhTNFαoretrytechniques.TheactivationprofilesofnuclearfactorNFκBinZR751cellsuntreatedand

2、treatedbymt471rhTNFαorechanisminducedbymt471rhTNFα.RESULTS:Theresultsfrom20g/LagarosegelelectrophoresisofgenomicDNAindicatedthatZR751cellstreatedbymt471rhTNFαprovidedatypicalapoptoticladderpatternofDNAfragmentation,etryshot471rhTNFαtreatedgroupt471rhTNFαheldastrongapoptosis

3、inducibleability.TheresultsofDNAbindingactivityofNFκBshot471rhTNFαt471rhTNFαort471rhTNFαissuperiortothatofaybethatNFκBactivationisinhibitedintumorcellstreatedt471rhTNFα.　　【Keys;mutanttype471rhTNFα;t471rhTNFα）和野生型rhTNFα（t471rhTNFα诱导肿瘤细胞发生凋亡的功能机制进行初步探究.方法：以乳腺癌细胞系ZR751细胞为靶细胞，应

4、用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt471rhTNFα和t471rhTNFα或t471rhTNFα处理组的ZR751细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布，t471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于t471rhTNFα处理组（P=0.002）.结论：mt471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于t471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要原因之一.　　【肿瘤；突变型471rhTNFα；野生型rhTNFα；NFκB；细胞凋亡　　0引言　　人肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNFα），主

5、要由巨噬细胞产生，是具有多种生物学活性的细胞因子.mt471rhTNFα是删除t471rhTNFα重组蛋白的基础上［2-4］，进行新的探究，为mt471rhTNFα的临床前探究提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达，初步检测具有良好的生物学活性.乳腺癌细胞系（ZR751）为本室保存.细胞培养基RPMI1640系GIBCOBRL产品，FCS购自杭州四季青生物技术公司.TransAMTMNFκBp65Kit由晶美生物工程有限公司提供.胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天生物技术探究所提供.　

6、　1.2方法　　1.2.1确定mt471rhTNFα和和260nm下的A值，确定蛋白的浓度；另取10μL加等体积2×蛋白电泳载样液，行150g/LSDSPAGE凝胶电泳，BackMan光密度扫描仪进行薄层扫描，以确定目的蛋白的含量.　　1.2.2两型rhTNFα诱导细胞凋亡复苏ZR751细胞，传代培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，Hank's液终止消化，收集细胞，并调整细胞数至2×108/L.将细胞分为3组，即ZR751对照组、t471rhTNFα处理组.培养基中放线菌素D的终浓度为0.5μg/L，样品终浓度为0.1mg/L，于加药后12h收集

7、细胞.将细胞分为两部分，一部分用于20g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，另一部分用于流式细胞分析，以PBS洗涤细胞，RNase降解RNA,700mL/L乙醇固定，待用.检测时，PBS洗涤以弃除700mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15min以上.PBS洗涤后，将细胞重新悬于1mLPBS中，用EPICSELITE,COULTER,USA型流式细胞仪分析比较两型TNFα诱导细胞凋亡的情况.　　1.2.3核蛋白的提取并定量按1.2.2的处理方法复苏并传代ZR751细胞，但样品终浓度分别为10μg/L和50μg/L，功能4h后收集细胞

8、，分别提取各实验组的细胞核蛋白质，操纵按试剂盒说明书进行，即：用PBS洗涤细胞，20μL细胞沉淀加进200μL细胞浆蛋白抽提试剂，振荡5s将细胞沉淀充分悬浮，加细胞