p38mapk和tnf

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1、p38MAPK和TNF【关键词】冬眠心肌肿瘤坏死因子αp38MAPKAbstract：ObjectiveTostudythechangesandsignificanceofp38MAPKandTNF-αmRNAinhibernatingmyocardium（HM）.MethodsTenpatientsinestressechocardiographyandDopplertissueimagetolocatethepositionofHM.Thespecimensofnormalmyocardium(NM)andHMedbyelectronmicro

2、scopy.p38MAPKandTNF-αmRNARNAinHMRNARNAareincreasedinischemicmyocardialcells.AsTNF-αmRNApromotestheactivationofp38MAPK,theytaybeimportantfactorsinthemolecularbiologyofHMformation.Keyyocardium;TNF-α;p38MAPK冬眠心肌(hibernatingmyocardium,HM)是由慢性冠状动脉缺血引起、能够保存残余收缩储备力因而对正性肌力刺激起阳性反应的一种心肌

3、的特殊状态，通过增加血流或降低氧耗，其功能可部分或完全恢复。HM是心肌功能为适应降低的血流供应而发生的匹配性下降，是存活的心肌在低灌注下防止自身坏死的自我保护状态。HM已成为近年来冠心病研究领域中的热点之一，但其形成的确切机制尚不完全清楚。近年来发现TNF-α能够促进心脏重构［1］，心脏重构指心肌细胞外间质数量和质量的变化及心肌细胞的凋亡，此外丝裂素活化蛋白激酶家族（mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs）可能参与了HM的形成。本研究观察冠心病患者HM细胞的p38MAPK、TNF-αmRNA的表达，并分析它们之间的

4、关系，初步探索HM形成的分子生物学机制。1材料和方法1.1实验材料兔抗P-P38购自美国SANTACRUZ公司；碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG、TNF-αmRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物公司。1.2心肌标本10例心肌标本均来自2004年8月—2006年3月在扬州大学附属医院心胸外科行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者，冠状动脉造影至少有1支冠状动脉狭窄程度大于85%，男7例、女3例，平均年龄（58.3±4.2）岁，病史均超过18个月。术中取HM及正常心肌（normalmyocardium，NM）。1.3HM定位1.3.1技术方法采用多巴酚

5、丁胺超声负荷试验(DSE)结合组织多普勒成像（DTI）技术，将左心室按美国超声心动图协会方法分为相对应的16个节段。1.3.2DSE检查方案试验分为静息、多巴酚丁胺10μg/(kg·min)、30μg/(kg·min)3个级别,每级负荷维持5min。于每级负荷时记录超声图像,并记录常规12导联ECG和血压。终止指标为:出现心绞痛；收缩压＜80mmHg或≥220mmHg(1mmHg=0.1333kPa)；出现严重心律失常；心率达到该患者年龄估算最高心率的85%；同一节段运动出现双相反应。1.3.3室壁节段运动异常的判定DTI测量心肌收缩期峰值平均运动

6、速度。如静息时平均运动速度低于正常速度，负荷10μg/(kg·min)多巴酚丁胺时心肌运动速度较静息时明显增高，负荷30μg/(kg·min)多巴酚丁胺时心肌运动速度反而减低，此时定义心肌运动呈双相反应，判定为HM。1.4心肌处理4%戊二醛、10％甲醛〔含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）〕、液氮固定,在电子显微镜下观察确认后分别进行原位杂交、APK蛋白含量心肌组织在冰浴的匀浆缓冲液中研碎成匀浆,4℃、1000r/min离心15min，取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，根据蛋白浓度取所需量的组织蛋白，加入1/3体积的4倍蛋白处理液，96℃100℃水

7、浴变性35min；经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离；电转至孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜（NC膜）上，转移完成后，加入封闭液，室温封闭5h；然后加入用封闭液稀释的一抗，4℃温育过夜；漂洗缓冲液洗膜3次，每次5min，加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗兔，IgG-AP)室温孵育2h；漂洗缓冲液、双蒸水洗膜后，以NBT/BCIP显色，显色反应达到要求后，水洗终止反应。ImageJ图像分析软件测定平均灰度值（间接反映蛋白表达水平）。1.7统计学处理计量数据以±s表示，统计软件采用SPSS13.0。组间比较采用t检验，

8、P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1病理结果电镜下可见HM与NM比较有以下一些特点：心肌纤维数量减少、稀疏，心肌纤