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1、TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNF论文.freelentusingGFPTNFfusionproteinanddetectedbyFCMandfluorescentmicroscope.TheinteractionbetinedbynondenaturedPAGEandtheinhibitoryeffectofTBPandTRBPonTNFαcytotoxicityagainstU937etry.TheeffectsofTBPandTRBPonthefunctionsofhumanmonocytesactivatedbyTNFαandIF
2、Nγinvitrobluechlorid(NBT)reductionassayforevaluatingrespiratoryburstandbyRTPCRforevaluatingIL1βandIL8mRNAtranscription.RESULTS:Itoreefficientlythantheindividualpeptideatalltestedconcentrations.ThebinationofTBPandTRBPonocytesinducedbyTNFαandIFNγandtranscriptionlevelofIL1βan
3、dIL8mRNAinducedbyTNFα.CONCLUSION:TBPorTRBPcanbindoreefficiently.Thisresearchentalbasisfortheclinicaltreatmentoftheinflammatorydisease.KeyRNA水平的抑制作用。结果:TBP和TRBP能抑制GFPTNF融合蛋白与细胞膜上TNFR的结合。非变性PAGE证明,TBP与TRBP之间的结合,为非配体和受体的结合;TBP和TRBP对TNFα的细胞毒效应均有抑制作用,且随着剂量的增加而增强,二者联用(即pep.38+X4
4、)效果更好。TBP和TRBP联用,.freelRNA的转录。结论:TBP和TRBP具有结合TNFα和TNFR的特异性,但二者的结合为非配体和受体的相互结合。TBP和TRBP对TNFα介导的各种生物学效应均具有抑制作用,二者联用效果更显著。关键词TNFα;TNF结合肽;TNFR封闭肽肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种主要由活化的单核/巨噬细胞产生的多效性细胞因子,可参与机体抗肿瘤、抗感染、调节免疫应答及炎症反应等多种生理和病理过程1-3。在急性炎症反应中,TNFα是一种起始的关键性的细胞因子,可诱导其他炎性细胞因子（如IL1β、IL6及IL8）
5、的表达,从而加剧炎症反应,引起发热、内毒素样休克等症状。在类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎及多发性硬化等自身免疫性疾病的发病过程中,TNFα也起关键性作用。因此,以TNFα及TNFR为靶点设计药物,可有效地阻断上述病理过程,达到治疗TNF相关的炎症性疾病的目的。本室曾分别以TNFα和TNFRI为诱饵,从噬菌体随机环肽库中筛选出能与TNF结合的环九肽,即TNF结合肽（TNFαbandingpeptide,TBP）和能与TNFR结合又不激活受体后反应的环九肽,即TNFR封闭肽（TNFRblockingpeptide,TRBP）4。本实验中进一步观察
6、了TBP和TRBP对TNFα介导的细胞毒效应、诱导IL1β、IL8的表达,以及促外周血单核细胞呼吸爆发的抑制作用,为研制TNF相关的抗炎药物奠定了基础。1材料和方法1.1材料STNFα标准品和MTT为Sigma公司产品。TRIzolRNA提取试剂为GIBCO公司产品。RTkit为MBI公司产品。TaqDNA聚合酶为biostar公司产品。PCR引物为上海博亚公司产品。TBP和TRBP由西安美联公司合成并环化,纯度均为95%。绿色荧光蛋白（GFP）TNF融合蛋白由本室制备。人单核细胞株U937细胞和小鼠成纤维细胞株L929细胞,均由本实验室保
7、存供实验使用。1.2方法1.2.1TBP和TRBP抑制TNFα和TNFR结合的作用取无菌盖玻片,置于6孔细胞培养板中,加入1×109个/L对数生长期的L929细胞,置37℃、50mL/LCO2细胞培养箱中培养过夜。取出制作细胞爬片,用10g/L多聚甲醛固定细胞30min。以PBS洗细胞后,滴加3mg/LGFPTNF融合蛋白和3mg/LTBP或TRBP,置4℃过夜。用PBS冲洗玻片后,在荧光显微镜下观察结果并拍照。另外,取1×109个/L对数生长期的U937细胞用10g/L多聚甲醛固定后,加入GFPTNF蛋白和合成环肽(3mg/L),置4℃过
8、夜,用流式细胞术检测。1.2.2TBP和TRBP抑制TNFα和TNFR的特点检测取以RPMI1640培养液溶解TBP(pep.38)与TRBP(pep.X4)（均为2g/L）,将
