噬菌体肽库跨膜型TNFα模拟肽的筛选及其体内外生物学功能的研究

《噬菌体肽库跨膜型TNFα模拟肽的筛选及其体内外生物学功能的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中科技大学硕士学位论文噬菌体肽库跨膜型TNF-α模拟肽的筛选及其体内外生物学功能的研究姓名：熊霞辉申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：李卓娅2003.5.1华中科技大学同济医学院硕士学位论文ABBREVIATIONSbybasepairBSAbovineSerumalbuminEDIAethlenediamineteraaceticacidE.coliescherichiacolihhourIPTGisopropyl-D-thiogalactopyranosideKDkilo-daltonLlitermgmi

2、lligrammIn面nuteODopticaldensityPAGEpolyacrylamidgelelectrophoresisPBSphosphatebuferedsalinePCRpolymerasechainreactionrpmroundperminuteSDSsoculiumdodecylsulfateTNF-atumornecrosisfactoralphasTNF-asecretedtumornecrosisfactoralphaTNFRtumornecrossfactorreceptorPMSF

3、pheylmethylsulfonylfluorideDEPCdiethylpyrocarbonateFll只Aenzyme-linkedimmunosorbentassayRTPCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction华中科技大学同济医学院硕士学位论文中文摘要l肿瘤坏死因子一a(TNF-a)是具有广泛生物学作用的细胞因子，参与机体抗肿瘤、抗感染、调节免疫应答、炎症反应等多种生理和病理过程。由于其对多种肿瘤细胞具有直接杀伤效应，故被命名为肿瘤坏死因子。TNF-a以

4、两种形式存在:即17kD的分泌型(secretedTNF-a,sTNF-a)和26kD的跨膜型TNF-a(transmembraneTNF-a,TM-TNF-a)。我们前期工作证实TM-TNF-a比sTNF-。具有更广的杀瘤谱，可杀伤sTNF-a耐受肿瘤细胞株，引起靶细胞凋亡，且无sTNF的促炎作用。提示TM-TNF可能具有比sTNF更有效更安全的临床抗瘤应用价值。但是TM-TNF-a必须以膜结合的形式才能发挥其生物学效应，故难以用于临床。噬菌体表面呈现技术(phagedisplaytechnology,PDT)是

5、一种噬菌体表面表达筛选技术。它将外源蛋白的基因型与表型联系在一起，以某种分子为钓饵，通过“吸附一洗脱一扩增”的亲和筛选过程，可以将与之特异性结合的噬菌体展示肤从表达有多种多样外源肤的噬菌体库中筛选出来;噬菌体随机肚文库可以用于筛选与抗体、受体、核酸等特异性结合的肤段，因此被广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及肤药物的研本研究以sTNFR1为钓饵，从噬菌体随机环肤库中筛选可模拟TM-TNF-a生物学活性的短肚，从而为研制类似TM-TNF-a抗瘤效应的新型肤类药物奠定基础.一、筛选模拟TM-TNF-“的曦菌

6、体展示肤1.噬菌体肚库的亲和筛选:以sTNFR1为靶分子，对噬菌体随机环肤库进行亲和筛选。在筛选过程中，通过降低靶分子的浓度、减少靶分子与2华中科技大学同济医学院硕士学位论文肤库的作用时间、增加洗脱强度等方法，去除非结合和弱结合的噬菌体肤，经三轮筛选后得到高度富集的、与TNFR具有高亲和力的特异性噬菌体克隆。2.用胞毒效应筛选TN-TNF-a模拟肤:随机挑取37个经三轮筛选后的噬菌体克隆，分别观察它们对sTNF-a敏感细胞株U937和耐受细胞株HL-60的胞毒效29个克隆既能杀伤U937细胞又能杀伤HL-细胞，4个

7、克隆仅U937细胞，4个克隆对二者都无胞毒效应即它们可能分别模拟TM-TNF-a,sTNF-a,TNF受体拮抗剂的作用。头3.TM-TNF-(x模拟肤氨基酸序列分析:从29个模拟TM-TNF-a噬菌体克隆中选取”个克隆进行噬菌体DNA测序，以此确定”基酸序列。份果7个克隆具有His-x-x-His基序，2个克隆具有Pro-x-x-Pro基序。9个“隆均“TNF一的氨基酸序”无同源性。)二、模拟TM-TNF-a噬菌体展示肤体外生物学活性1.不同噬菌体展示肚致肿瘤细胞死亡方式的比较:本室的前期研究工作证实:TM-TNT

8、-a主要引起靶细胞的凋亡，而sTNF-a则主要引起靶细胞的坏死。将TNF和噬菌体展示肤作用于HepG2细胞3h后，用Annextin-VFITC和PI对HepG2细胞进行染色。R果证“sTNF-a及其模拟噬菌体展示肤只引起极少量细胞的坏死MUTM-TNF-a及其模拟噬菌体展示“则分别引起51.04%和38.54%的细胞凋亡。多2.不同噬菌体展示肤对SODDm