钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究

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1、浙江大学博士学位论文钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究姓名：许晓华申请学位级别：博士专业：临床医学指导教师：赵小英20120524钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究研究背景：浙江大学医学院博士研究生导师内科学(血液病学)许晓华赵小英教授中文摘要慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一种造血干细胞的克隆性疾病，约占成人白血病的15％．20％，是严重危害人类健康的血液系统恶性肿瘤。CML患者存在Ph染色体，即9号染色体c．abl癌基因

2、易位到22号染色体bcr基因处，形成bcr-abl融合基因，bcr-abl融合基因编码BCR—ABL融合蛋白，该蛋白具有酪氨酸激酶活性，促进细胞异常增殖，导致CML的发生和发展。伊马替尼(imatinib)是一种酪氨酸激酶抑制剂，对CML患者具有良好的疗效，并于2001年获美国FDA批准成为治疗CML的一线药物。然而，已有越来越多的临床和实验研究资料显示，伊马替尼虽然对CML慢性期患者有较好的疗效，却对急变期CML疗效较差，而且随着伊马替尼的广泛应用，发现有相当一部分患者出现耐药。研究认为分子靶向药物对急变期CML无效主

3、要与其致病基因bcr-abl发生突变有关，如T315I突变。T315I突变患者不仅对第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药，对第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib)和尼洛替尼(Nilotinib)也耐药。近年来，随着对白血病细胞生物学和分子生物学特性研究的深入，发现白血病干细胞(1eukemiastemcell，LSC)不仅是CML对分子靶向药物耐药的关键因素，而且在IT白血病起始和复发中也起着重要的作用，LSC是CML长期缓解和治愈的主要障碍之一。CML患者要获得长期缓解和治愈，必需清除这些白血病干细胞。因此

4、，筛选和鉴定白血病干细胞治疗性药物靶标，阐明其作用分子机制，以及研发相应药物是目前迫切需要解决的问题之一。目前抗肿瘤药物大多存在毒副反应大，价格昂贵等不足，因此寻找高效低毒价廉的抗肿瘤药物和方法，提高患者生存质量已成为医学研究的热点。汉防己甲素(tetrandrine，TTD)又名粉防己碱，是从防已科千金藤属植物粉防已(StephamiatetrandraS．Moore)块根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，是一种钙调素拮抗剂，对多种肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制作用。有文献报道钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶II丫(CaMK

5、II丫)在很多肿瘤细胞中呈异常表达，研究发现CaMKII丫在髓系白血病细胞中呈异常激活状态并调节白血病细胞的增殖。汉防己甲素对慢性粒细胞白血病急性变白血病细胞株K562细胞和多药耐药株K562／ADM细胞体内外均有较好的抗增殖和逆转多药耐药的作用，但其作用机制尚缺乏深入的研究。因此，本文以K562细胞及伊马替尼耐药的K562R细胞和慢性粒细胞白血病患者原代细胞为研究对象，探讨钙调素拮抗剂枸橼酸汉防己甲素(Tetrandrinecitrate，TTDC)体内外抗慢性粒细胞白血病作用及其可能的机制。第一部分：枸橼酸汉防己甲素

6、抑制人慢性粒细胞白血病细胞增殖的体外研究目的：检测枸橼酸汉防己甲素对人慢性粒细胞白血病细胞增殖抑制作用。方法：用TTDC处理慢性粒细胞白血病细胞株(K562细胞和K562R细胞)和慢性粒细胞白血病患者原代细胞，采用MTT检测处理前后对白血病细胞的增殖抑制作用，Wright—Giemsa染色观察细胞的形态的变化；流式细胞仪分析细胞DNA含量及细胞凋亡；甲基纤维素克隆形成试验检测TrDC对白血病细胞克隆的增殖抑制作用；运用WesternBlot技术检测BCR—ABL蛋白及其磷酸化蛋白表达。结果：不同浓度(0—169#m1)的

7、TrDC分别作用于K562细胞和K562R细胞24h、I!I48h、72h能显著抑制K562细胞和K562R细胞的增殖，其作用具有浓度．时间依赖性，TTDC对K562细胞和K562R细胞在48hIC50分别是2．781ae,／ml和3．511a∥ml，同样TTDC对慢性粒细胞白血病患者原代细胞也具有增殖抑制作用而对正常造血细胞没有明显抑制作用。T'I'DC处理K562R细胞出现凋亡细胞形态学的改变和凋亡细胞比例的增加，K562R细胞经1．o“g／ml、2．O斗∥ml、4．0“∥ml和8．099／mlTTDC分别处理48h

8、后，早期凋亡细胞比例分别为3．1％，7．3％，50％和76％，呈明显递增趋势，甲基纤维素克隆形成试验结果显示TTDC能抑制CML细胞克隆形成，同时观察到经TTDC作用后P210Bc艮ABL蛋白表达量明显下降。结论：TrDC能够抑制K562细胞和K562R细胞的增殖，其作用具有浓度一时间依赖性，对慢性粒细胞白血病患者原