绵羊tlr4基因的克隆序列分析及功能验证杜金苓ppt培训课件

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1、绵羊TLR4基因的克隆、序列分析及功能验证报告人：杜金苓导师：连正兴单位：中国农业大学时间：2009.10.13引言养羊业面临疾病的危险如：布氏杆菌病造成直接经济损失每年达数亿元，间接经济损失每年超过100亿布氏杆菌主要侵害生殖系统，引起流产，并可诱发人兽共患，目前已遍布全世界，动物阳性感染率0.36%，人阳性感染率3.28%革兰氏阴性菌：巴氏杆菌、弯曲菌、布氏杆菌---TLR4基因TLR4:细胞壁中的LPS、LTA前炎症因子:IL-6、IL-8、TNF-α等IFN(zhengshijun)实验内容克隆绵羊TLR4基因多个克隆测序分析构建融合蛋白与非融合蛋白表达载体在细胞水平进行功能验

2、证探讨作用机制引物设计：P2P3P11.上游引物2.下游引物：P1`:5`CGCATCAGGGGATTCTCCTC3`:(P3)EcoRI融合蛋白P3`:5`TCCCCCGGGGGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTGC3`非融合蛋白P3``:5`TCCCCCGGGTCAGGTGGAGGTGGTCGCTTCTTG3`SmaI1.RT-PCR(P1、P1`)2.菌液PCR鉴定I3.提取阳性菌质粒1.质粒PCR(P2:加入前51bp)2.回收纯化3.连接peasy-blunt-simple载体4.菌液PCR5.提取质粒6.多个克隆测序鉴定II三种片段长度，比例各不相同2520bp、274

3、2bp（+222bp）、2353bp(-167bp)standard：2520bpinsertion:2742bpdeletion:2353bp结果TheJournalofImmunologyMicrobesandInfection9(2007)1359-1367OvisTLR4genedeletionstandardinsertionexon2Alternativeexon25+56=83aa222bpexon125+4=29LPS刺激后，各种剪接体比例发生变化寻找开放阅读框构建表达载体探讨调节机制及功能outside1—633aaTMhelix634—656aainside657—

4、840aaSignalP-NNresult:Mostlikelycleavagesitebetweenpos.24and25:TES-WDSignalpeptide:TMHMM:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/nph-webface构建standardTLR4表达载体酶切鉴定筛选细胞系1=pTLR4-IRES-EGFP2=afterdigest（7kb、900bp）M=markerpTLR4-EGFP载体：细胞定位pTLR4-IRES-EGFP载体：功能研究pTLR4-IRES-EGFP转染胎儿

5、成纤维细胞TNF-αIL-6IL-8CTNF-αIL-6IL-8T0.50.522448812122424(h)TNF-αIL-6IL-8结论发现绵羊TLR4基因的三种剪接体筛选出过表达TLR4基因的成纤维细胞系初步了解LPS刺激过表达TLR4基因的成纤维细胞后，IL-6、IL-8表达量升高，TNF-α的表达具有时效关系！Thankyou