转录因子对干细胞高效定向分化为β细胞的作用

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第24卷第2期生命科学Vol.24,No.22012年2月ChineseBulletinofLifeSciencesFeb.,2012文章编号：1004-0374(2012)02-0145-05转录因子对干细胞高效定向分化为β细胞的作用陈桃，齐晖，李富荣*(1暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)风湿科，深圳518020；2深圳市老年医学研究所，深圳518020)摘　要：移植干细胞分化的胰岛β细胞能逆转糖尿病鼠的高血糖症，为细胞疗法临床应用于糖尿病治疗提供依据。但如何诱导干细胞高效、定向分化为具有分泌功能的胰岛β细胞，仍是当今世界难题。就影响干细胞分化为胰岛β细胞的关键转录因子PDX-1、Ngn3、NeuroD1、MafA的作用及机制进行综述，为干细胞高效定向分化提供新的思路。关键词：干细胞；β细胞；分化；转录因子中图分类号：Q254；Q813文献标志码：AEffectoftranscriptionfactorsondifferentiationintoinsulin-producingcellsfromstemcellsCHENTao,QIHui,LIFu-Rong*(1DepartmentofRheumatism,theSecondAffiliatedHospital(ShenzhenPeople’sHospital)ofJinanUniversity,Shenzhen518020,China;2ShenzhenInstituteofGerontology,Shenzhen518020,China)Abstract:Transplantationofinsulin-producingcellsderivedfromstemcellscouldreversehyperglycemiaindiabeticmice,whichsupporttheevidenceofcellreplacementtherapyofdiabeticsinclinicaluse.Buttheprotocalthathowtoinducedifferentiationofstemcellsintoinsulin-producingcellseffectivelyanddirectively,stillisaworldwideproblem.Thisreviewaimstopresentmechanismaboutdifferentiationintoinsulin-producingcellsfromstemcellswithkeytranscriptionfactorsPDX-1,Ngn3,NeuroD1,MafA.Itisanewwayfortheefficientanddirectionaldifferentiationfromstemcellintoinsulin-producingcells.Keywords:stemcell;βcell;differentiation;transcriptionfactors对于丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，胰1胰岛β细胞的发育过程及相关转录因子岛移植是治愈糖尿病的最具潜力的方案之一，但胰胚胎发育过程中，前肠内胚层细胞增生的岛供体短缺，严重影响其在临床的广泛应用。近年同时Shh信号转导通路受抑制，即可激活PDX-1研究表明，干细胞分化而来的胰岛β细胞有望成为(pancreaticandduodenalhomeoboxfactor-1,胰十二糖尿病治疗新的细胞来源。但目前胚胎干细胞、成[1-2]指肠同源盒基因-1)，指导前肠内胚层背、腹胰体干细胞和iPS细胞体外分化为胰岛β样细胞效率芽生长；随着胰腺祖细胞分化，先后形成背胰芽和低、成熟度差，难以满足临床治疗的需要。深入了腹胰芽。当背胰和腹胰不断分支、融合，胰腺祖细解干细胞向胰岛β细胞诱导分化的分子调控机制，将有助于提高分化效率及完善胰岛β样细胞的功能。收稿日期：2011-08-06；修回日期：2011-10-23本文就影响干细胞分化为胰岛β细胞的关键转录因基金项目：国家重点基础研究计划(“973”项子PDX-1、Ngn3、NeuroD1、MafA等在干细胞高目)(2004CCA01500)；广东省自然科学基金项目效定向分化为胰岛β细胞中的作用及机制进行了综(6027540)；深圳市科技计划项目(201001002)述，为干细胞高效定向分化提供新的思路。*通信作者：E-mail:frli62@yahoo.com 146生命科学第24卷胞向三个方向发育：腺泡、导管、内分泌祖细胞。2干细胞分化为胰岛β细胞中转录因子的作用Notch信号是决定胰腺祖细胞向内、外分泌细胞形胰腺发育受复杂的网络调控，其中胰岛β细胞成的临界信号。若Notch信号被激活时，bHLH蛋的分化及胰岛素基因的表达需要多个转录因子，如白Hes-1的表达启动，可抑制Ngn3(neurogenin3，PDX-1、Ngn3、NeuroD1、Pax4、MafA等时序性神经元素3)的表达，诱导细胞向外分泌祖细胞分表达，进而激活多个信号途径。尽管胰腺发育具体化；若HNF3β结合Ngn3启动子，开启Ngn3的表达，的确切机制尚未完全明确，研究者们利用已知的重则抑制Notch信号，诱导细胞向内分泌祖细胞分[3]要相关因子，模拟β细胞发育过程，运用基因转染化。随后，位于下游的NeuroD1(neurogenicdiff-的方法诱导各种干细胞为胰岛素β细胞，为诱导分erentiationfactor1，又称BETA2，神经性分化因子1)，化的策略提供了宝贵的经验。但鉴于体外或体内环在IA1协同作用下指导Pax4(pairedboxgene4，成境复杂，基因转染面临能否持续表达以及基因变异对盒基因4)及ARX(aristalessrelatedhomeobox)双的问题，难以短期内广泛应用于临床；再者，β细阳性的β/δ前体细胞生成。其中，Pax4(+)的前体胞发育需要多个基因的时序性表达，若多个基因同细胞被依次激活MafA(Musmusculusv-mafmuscu-时开启，可能反而抑制相关发育基因的开启，从而loaponeuroticfibrosarcomaoncogenefamilyproteinA，影响干细胞分化为胰岛β细胞的效率和成熟度。因肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A)、Nkx2.2(NK2此，人为直接添加相关转录因子的产物——蛋白质，transcriptionfactorrelated,locus2)、Nkx6.1(NK6[4]并利用蛋白质自身或外源的跨膜结构域穿过细胞homeobox1)后，Ngn3表达开始下调，并在Hlxb9膜，于细胞内诱导干细胞为胰岛β细胞可能是高效(homeoboxgeneHB9,同源框HB9)、Isl-1(Islet1)、定向分化的新策略。下面就各转录因子通过基因转Pax6(pairedboxgene6,成对盒基因6)、PDX-1的染或蛋白质转导的方法，在干细胞分化为β细胞中共同作用下，细胞呈团簇状聚集生成，最终发育为的作用作一概括。分泌胰岛素的β细胞(见图1)。2.1PDX-1PDX-1被认为是胰腺内分泌细胞发育的主要调控因子，最早在胚胎发育早期的肠道中表达，除直接指导、维持前肠内胚层向胰腺祖细胞发展外，还通过结合调控蛋白HNF3β而实现调控胰腺内分泌细胞的生成。随着胰腺发育，PDX-1表达有所下降，但在成体中持续表达，维持着β细胞的表型、胰岛素基因的转录以及胰岛素颗粒的成熟与分泌，该功能是PDX-1蛋白通过结合胰岛素基因转录调控区A3(-201~-196bp)而实现的。至于PDX-1的激活，可能与PDX-1调控序列中占据多个位点的Foxa1[5]和Foxa2有一定关系。基于以上机制，学者们视PDX-1为重编程细胞的有力武器，构建表达外源性PDX-1基因的胚胎干细胞系，诱导其分化为胰岛素分泌细胞，结果发现细胞中胰岛素2、生长抑素、Kir6.2、葡萄糖激酶、Ngn3、Pax6、PC2及HNF6的表达明显增强了，且分泌胰岛素54ng/mg上清蛋白，但无明显糖[6][7]依赖的胰岛素分泌。最近Kajiyama等将转染PDX-1基因的小鼠脂肪干细胞移植到糖尿病模型小鼠体内，希望利用体内环境诱导为胰岛素分泌细胞；免疫组化实验显示平均每张胰腺组织切片中，每12[8]图1胚胎干细胞向β细胞发育示意图个脂肪干细胞就约有3个细胞表达C肽。Yuan等 第2期陈桃，等：转录因子对干细胞高效定向分化为β细胞的作用147在体外利用重组PDX-1转染大鼠骨髓间充质干细内源性Insulin2表达，而联合MafA及Ngn3则可[18]胞，诱导后胰岛素分泌细胞DTZ着色约占32%，同时诱导内源性Insulin1、Insulin2表达。国内高糖刺激第5天胰岛素释放量(9.1mIU/L)是低糖有实验室以流产人胎儿胰腺组织克隆出人Ngn3基组的9倍，但9d后明显下降，推测可能在高糖刺因，并构建了pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体及激下，PDX-1先进入细胞核激活Ngn3及招募相关其包装细胞株，为下一步将Ngn3基因导入人胎儿胰[19]蛋白，进而超激活胰岛素及β细胞相关基因的表达。腺祖细胞，提高诱导分化效率的研究奠定了基础。当联合转染PDX-1及Betacellulin基因，大鼠骨髓2.3NeuroD1间充质干细胞分化的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的NeuroD1最先被发现于发育的胰腺上皮细胞量为单独PDX-1组的5倍，但在葡萄糖刺激下释中，与Ngn3同属bHLH蛋白转录调控因子，且受[9][20]放胰岛素及C肽的量仅为正常胰腺的3%。Ngn3的调控。胚胎出生后NeuroD1可在α、β为比较PDX-1、PDX-1-VP16、TAT-PDX-1、TAT-及δ细胞中表达，激活Glucagons、Insulin及胰岛[21]PDX-1-VP16四种蛋白的转导及诱导效果，Delisle素分泌基因，对胰腺的分化成熟是不可或缺的。[10][22]等分别将其与大鼠肝脏上皮干细胞WB细胞共Noguchi等发现用腺病毒感染小鼠或人的胰腺培养14d，发现除含VP16的融合蛋白外，其他蛋前体细胞，并诱导其为胰岛素分泌细胞时，整合白均能激活大鼠Insulin2启动子，但RT-PCR未见NeuroD1的腺病毒比整合PDX-1、Ngn3或Pax4的大鼠Insulin2表达；胰腺发育相关基因(Ngn3、更能诱导Insulin基因表达。也有联合NeuroD1转NeuroD1、Pax-4、Nkx2.2、Nkx6.1、PDX-1)及β细染及小分子化合物者，诱导人脐带间充质细胞为胰胞成熟相关基因(Glut-2、Kir6.2、Insulin)，诱导后岛素分泌细胞团，并表达内源性PDX-1、Insulin等[23]有不同程度的表达。研究表明，同为大鼠WB系肝胰腺β细胞相关基因。干细胞，在激活PDX-1下游NeuroD转录水平的效2.4MafA率上，PDX-1转染效率(20%)与重组PDX-1蛋白MafA是Maf家族的一员，具有亮氨酸拉链[11]诱导效率(19%)相当。也有人添加外源性PDX-(bZip)结构，仅在成体胰腺的β细胞中表达，可调1VP16蛋白成功将人胚胎干细胞体外诱导为胰腺内控胰岛素合成、分泌和糖代谢等相关基因的表达。[12]分泌细胞，其中约30%为β样细胞。其特异结合于胰岛素基因C1元件，与PDX-1、β2.2Ngn3细胞E盒反式作用因子共同调节Insulin的转录，Ngn3属于碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-对胰腺生长，特别是β细胞的功能成熟起着重要作loop-helix，bHLH)转录因子家族，对胰腺内分泌细用。[13-14]胞的发育是必要的，且具有剂量效应。研究表MafA比PDX-1更能增强新生大鼠β细胞在葡[15][24]明，Ngn3影响雏鸡内胚层细胞的迁徙和分化。萄糖刺激下的胰岛素分泌能力。另一方面，由于但胰芽发育后，内分泌祖细胞中Ngn3的表达仅是MafA是高度磷酸化蛋白，抑制p38MAPK可促进[16]短暂的，胎儿出生后则检测不到其表达，推测MafA在细胞中的稳定表达；换言之若诱导过程中Ngn3在调控胰腺发育中发挥开关作用。因为当避免p38MAPK介导的MafA的退化，可能是改善[25]Ngn3高表达时，可能启动了其抑制作用或未知的β细胞功能、促进成熟度的一个有效措施。最近反馈机制，下调Ngn3(+)的细胞数目，从而影响内美国有实验室将TAT-MafA融合蛋白通过子宫内注[14]分泌祖细胞与外分泌祖细胞的比例。在大鼠胚射到胚胎心脏，促进了胚胎后期胰腺前体细胞的成胎胰腺发育及成体胰岛修复中，Ngn3表达降低时，熟，以及转录水平上Insulin1、Insulin2、Glut2等胰[26]位于其下游调控胰岛细胞分化、成熟、功能化的相腺发育或成熟相关基因的上调，且表达Insulin。关基因，如NeuroD1、Nkx2.2、Pax4等表达就会2.5多个转录因子联合作用[17]减少，最终导致胰岛内分泌功能障碍。研究表明影响干细胞高效定向分化的重要转由此可见，Ngn3不仅是诱导内分泌细胞分化录因子包括PDX-1、Ngn3、NeuroD1、MafA。PDX-1[8]的重要因子，也是促进胰岛成熟和维持胰岛功能的与Ngn3在激活其他转录因子时具有协同作用。重要因子。在腺病毒感染AR42J-B13向β细胞分PDX-1开启Ngn3的同时激活下游转录因子的交叉[2]化的体外系统中，研究人员认为Ngn3是小鼠胚胎网络，胚胎干细胞或胰腺祖细胞即向β细胞分化。发育中必不可少的，若联合Nkx6.1及Ngn3仅诱导此外，PDX-1也位于MafA增强子的3'区域，与 148生命科学第24卷MafA共同参与Insulin转录水平的正反馈机制。可胞治疗。见，联合多个转录因子有望将干细胞高效定向分化为胰岛β细胞并促进其成熟。[参　考　文　献][27]Zhao等将分别整合外源PDX-1、NeuroD1、[1]VandenBrinkGR.HedgehogsignalingindevelopmentNgn3基因的三种病毒同时感染人骨髓间充质干细andhomeostasisofthegastrointestinaltract.PhysiolRev,胞6d后，培养基上清中检测到含胰岛素约2202007,87(4):1343-756[2]Oliver-KrasinskiJM,KasnerMT,YangJX,etal.TheμU/3×10细胞，体外对葡萄糖刺激无反应说明其diabetesgenePdx1regulatesthetranscriptionalnetwork成熟度较差，而移植到糖尿病鼠体内后有12.5%的ofpancreaticendocrineprogenitorcellsinmice.JCli细胞表达Insulin并有效降低模型鼠的血糖水平，Inves,2009,119(7):1888-98[3]Cras-MeneurC,LiL,KopanR,etal.Presenilins,Notch可见体内高血糖环境促进细胞一定程度分化，遗憾dosecontrolthefateofpancreaticendocrineprogenitors的是并未检测到SUR1(一种胰岛素分泌调节的Kduringanarrowdevelopmentalwindow.GenesDev,2009,离子通道组分)的表达。有研究为筛选诱导分化的23(17):2088-101[4]RathMF,BaileyMJ,KimJS,etal.Developmentaland关键转录因子，将分别导入MafA、PDX-1、Ngn3、dailyexpressionofthePax4andPax6homeoboxgenesinNeuroD1、Isl-1、Pax6、Pax4、Nkx2.2和Nkx6.1基theratretina:localizationofPax4inphotoreceptorcells.J因的腺病毒混合注射到免疫缺陷小鼠的胰腺内，免Neurochem,2009,108(1):285-94疫组化实验显示有适量胰岛素细胞生成，进而每[5]GaoN,LeLayJ,VatamaniukMZ,etal.DynamicregulationofPdx1enhancersbyFoxa1andFoxa2is次剔除一种腺病毒重复试验，结果发现MafA、essentialforpancreasdevelopment.GenesDev,2008,PDX-1、Ngn3腺病毒是必不可少的，且此组合可诱22(24):3435-48导大于20%的感染细胞分化为胰岛素分泌细胞，其[6]MiyazakiS,YamatoE,MiyazakiJ.Regulatedexpressionofpdx-1promotesinvitrodifferentiationofinsulin-胰岛素分量与内源性β细胞相当，且3个月后细胞producingcellsfromembryonicstemcells.Diabetes,[28]仍存活。猪的器官与人体的最为相近，因此有研2004,53(4):1030-7究者尝试诱导新生猪的胰腺导管细胞为胰岛素分[7]KajiyamaH,HamazakiTS,TokuharaM,etal.Pdx1-transfectedadiposetissue-derivedstemcellsdifferentiate泌细胞：当目标细胞联合转染PDX-1、NeuroD1及intoinsulin-producingcellsinvivoandreducehyperg-MafA基因后，表达内源性胰岛素基因，且诱导结lycemiaindiabeticmice.IntJDevBiol,2010,54(4):699-束后移植于裸鼠肾包膜下的细胞仍具良好的增殖705[29][8]YuanH,LiJ,XinN,etal.ExpressionofPdx1mediates能力并趋于成熟。differentiationfrommesenchymalstemcellsintoinsulin-与基因转染类似，研究者也希望通过联合蛋白producingcells.MolBiolRep,2010,37(8):4023-31[30][9]LiLS,LiFR,QiH,etal.CoexpressionofPdx1and诱导找出更高效、更安全的诱导方案。Noguchi等betacellulininmesenchymalstemcellscouldpromotethe联合运用重组PDX-1蛋白及NeuroD1蛋白成功诱differentiationofnestin-positiveepithelium-likeprogeni-导人胰腺前体细胞分化为胰岛素分泌细胞，并表达torsandpancreaticislet-likespheroids.StemCellsDev,胰腺相关基因，但30d后该细胞开始衰老，并停止2008,17(4):815-23[10]DelisleJC,MartignatL,DubreilL,etal.Pdx-1orPdx-1-分化。可见，蛋白质转导的策略尚需不断的完善。VP16proteintransductioninducesβ-cellgeneexpression3干细胞分化为胰岛β细胞存在的问题inliver-stemWBcells.BMCResNotes,2009,2:3[11]KoyaV,LuS,SunYP,etal.Reversalofstreptozotocin-目前如何诱导产生大量的功能性β细胞仍是一induceddiabetesinmicebycellulartransductionwithrecombinantpancreatictranscriptionfactorpancreatic个巨大挑战，这可能与两方面原因有关：(1)胰腺duodenalhomeobox-1-Anovelproteintransduction发育的具体机制与信号转导通路尚未明确，无法利domain-basedtherapy.Diabetes,2008,57(3):757-69[31][12]BernardoAS,ChoCHH,MasonS,etal.Biphasic用转录因子精确调控干细胞分化；(2)干细胞的inductionofPdx1inmouseandhumanembryonicstem增殖分化行为一方面被细胞本身预先程序化，另一cellscanmimicdevelopmentofpancreaticβ-Cells.Stem方面受其所处的微环境(干细胞壁龛)的影响，即Cells,2009,27(2):341-51包括细胞与细胞、细胞与细胞外基质两种方式，体[13]GradwohlG,DierichA,LeMeurM,etal.neurogenin3isrequiredforthedevelopmentofthefourendocrinecell外难以模拟复杂的体内微环境。我们需要不断深入lineagesofthepancreas.ProcNatlAcadSciUSA,2000,研究胰岛发育过程中的分子机制，寻求高效定向分97(4):1607-11化干细胞为β细胞的方案，最终实现糖尿病的干细[14]WangS,YanJB,AndersonDA,etal.Neurog3gene 第2期陈桃，等：转录因子对干细胞高效定向分化为β细胞的作用149dosageregulatesallocationofendocrineandexocrinecelldifferentiateintoinsulin-producingcellsinvitro.Chinfatesinthedevelopingmousepancreas.DevBiol,2010,MedJ(Engl),2011,124(10):1534-9339(1):26-37[24]Aguayo-MazzucatoC,KohA,ElKhattabiI,etal.Mafa[15]RosenbergLC,LafonML,PedersenJK,etal.Theexpressionenhancesglucose-responsiveinsulinsecretiontranscriptionalactivityofNeurog3affectsmigrationandinneonatalratbetacells.Diabetologia,2011,54(3):583-differentiationofectopicendocrinecellsinchicken93endoderm.DevDyn,2010,239(7):1950-66[25]KondoT,ElKhattabiI,NishimuraW,etal.p38MAPKis[16]WatadaH.Neurogenin3isakeytranscriptionfactorforamajorregulatorofMafAproteinstabilityunderoxidativedifferentiationoftheendocrinepancreas.EndocrJ,2004,stress.MolEndocrinol,2009,23(8):1281-9051(3):255-64[26]VargasN,Alvarez-CubelaS,GiraldoJA,etal.TAT-[17]WangS,JensenJN,SeymourPA,etal.SustainedNeurog3mediatedtransductionofMafAproteininuteroresultsinexpressioninhormone-expressingisletcellsisrequiredenhancedpancreaticinsulinexpressionandchangesinforendocrinematurationandfunction.ProcNatlAcadSciisletmorphology.PLoSOne,2011,6(8):e22364USA,2009,106(24):9715-20[27]ZhaoM,AmielSA,AjamiS,etal.Ameliorationof[18]OgiharaT,FujitaniY,UchidaT,etal.Combinedstreptozotocin-induceddiabetesinmicewithcellsderivedexpressionoftranscriptionfactorsinducesAR42J-B13fromhumanmarrowstromalcells.PLoSOne,2008,3(7):cellstodifferentiateintoinsulin-producingcells.EndocrJ,e26662008,55(4):691-8[28]KanetoH,MatsuokaT,KatakamiN,etal.Combinationof[19]楚元奎,吕长荣,陈冬梅,等.人神经元素3基因重组逆MafA,PDX-1andNeuroDisausefultooltoefficiently转录病毒表达载体的构建及其包装细胞株的建立.生induceinsulin-producingsurrogateβ-cells.CurrMed物工程学报,2010,26(4):448-53Chem,2009,16(24):3144-51[20]HuangHP,LiuM,El-HodiriHM,etal.Regulationofthe[29]YouYH,HamDS,ParkHS,etal.Adenovirusespancreaticislet-specificgeneBETA2(neuroD)byexpressingPDX-1,BETA2/NeuroDandMafAinducestheneurogenin3.MolCellBiol,2000,20(9):3292-307transdifferentiationofporcineneonatalpancreascell[21]LeeJC,SmithSB,WatadaH,etal.Regulationoftheclustersandadultpigpancreaticcellsintoβ-cells.pancreaticpro-endocrinegeneneurogenin3.Diabetes,DiabetesMetabJ,2011,35(2):119-292001,50(5):928-36[30]NoguchiH,NaziruddinB,ShimodaM,etal.Inductionof[22]NoguchiH,XuG,MatsumotoS,etal.Inductionofinsulin-producingcellsfromhumanpancreaticprogenitorpancreaticstem/progenitorcellsintoinsulin-producingcells.TransplantProc,2010,42(6):2081-3cellsbyadenoviral-mediatedgenetransfertechnology.[31]LiewCG.Generationofinsulin-producingcellsfromCellTransplan,2006,15(10):929-38pluripotentstemcells:fromtheselectionofcellsourcesto[23]WangHW,LinLM,HeHY,etal.Humanumbilicalcordtheoptimizationofprotocols.RevDiabetStud,2010,mesenchymalstemcellsderivedfromWharton’sjelly7(2):82-92