干细胞因子对人白血病细胞的作用研究

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1、中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8刖青”””“”””””””””一”””“”””””””一“““”““”8第一章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11第二章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30弟一覃⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘3U讨论·································

2、·································45参考文献1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49综述·································································．52参考文献2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64攻读硕士期间发表的文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70缩写词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71硕士学位论文的资助项目⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73致谢·············

3、··-··················································74中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文干细胞因子对人白血病细胞的作用研究摘要干细胞因子(stemcellfactor，scF)是一种多功能细胞因子，参与机体发育中多种细胞的增殖调控，是多种哺乳动物干细胞增殖分化的关键因子。它可与细胞表面c—kit受体结合，作用于早期造血干／祖细胞，在维持其存活、促进增殖、及调控其向各系造血分化中起重要作用。人SCF由外显子6蛋白酶解位点选择性剪接形成可溶型(sSC

4、F)与膜结合型(mSCF)两种形式，二者在造血中的作用有所不同。sSCF参与干／祖细胞的动员，而mSCF则被认为是造血微环境“niche"的重要组成分子，参与造血干细胞与“niche"之间的相互作用，造血微环境缺乏mSCF导致造血干细胞重建造血障碍。在恶性实体肿瘤中，sSCF／c—kit通过自分泌作用促进肿瘤生长和转移，而c—kit表达阳性的肿瘤细胞被认为具有肿瘤干细胞样性质。在血液系统恶性疾病中，63％的急性髓系白血病(AML)患者c—kit表达阳性，其中2／3同时伴有异常CD34+指标的患者不易缓解、易复发、

5、预后不良。以往的研究主要阐明了sSCF通过自分泌机制促进肿瘤细胞的恶性表型，我们已有的结果提示mSCF在部分白血病中有高表达，在AML患者和正常人骨髓单个核细胞中均有sSCF、mSCF、c—kit三种基因产物的表达，其中AML患者与正常人骨髓细胞c—kitmRNA、mSCFmRNA水平差异有统计学意义，而sSCFmRNA水平差异无统计学意义。本论文在此基础之上，用DNA重组技术成功构建了人可溶型及膜结合型干细胞因子的重组逆转录病毒表达载体MSCV—PGK—GFP—sSCF、MSCV—PGK—GFP—mSCF，二者

6、与空载体MSCV—PGK—GFP分别转染Phoenix细胞，包装出含有目的基因的假病毒颗粒并成功感染了NIH3T3细胞，流式细胞术筛选后的阳性克隆经合适剂量射线照射后，各自作为滋养层细胞与c—kit受体阳性的K562细胞共培养，CCK8法分别检测共培养体系中K562细胞的增殖情况，结果发现，10％血清浓度条件下共培养48、72小时，NIH3T3一S、NIH3T3一M孔中的K562细胞增殖能力均显著高于NIH3T3一V孔(尺0．01)，而前两者K562细胞的增殖没有显著差异(乃0．05)；1％血清浓度条件下共培养2

7、4、48和72小时，NIH3T3一S、NIH3T3一M孔中的K562细胞增殖能力均显著高于NIH3T3一V中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生学位论文(KO．01)，且NIH3T3一M孔高于NIH3T3一S孔(K0．05)。上述结果提示导入的两种形式人干细胞因子基因可以在细胞中稳定有效的表达，并发挥作用，感染的NIH3T3细胞通过表达sSCF、mSCF促进K562细胞的增殖；在低血清条件下mSCF的作用更强；同时，我们建立了一种可行的共培养方法，可以提供稳定的SCF信号，为积极探索有效的重建造血的方法奠定宝贵的

8、实验基础。本室前期的研究初步表明了本身有c—kit受体表达的K562细胞分别转染两种形式人干细胞因子后，mSCF与c—kit之间的自身并置性作用显著促进K562细胞的增殖，为了进一步证明这种作用是二者通过自激环路实现的，我们将已经构建好的sSCF前体的真核表达质粒pTARGET—s和msCF的真核表达质粒pTARGET—m以及空载体pTARGET—v通过脂质体介导转染R锄