重组人干细胞因子的研究

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1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%&年!!月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+(,-./-0$%%&!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!重组人干细胞因子的研究吴军巩新唱韶红赵志虎左从林"马清钧""（军事医学科学院生物工程研究所，北京!%%%:!）摘要利用基因工程的方法制备了高纯度的人干细胞因子，并对制备的重组人干细胞因子的结构和生物活性进行了研究。结果表明0EGH7在磷酸盐缓冲液中以非共价的二聚体形式存在，其精确分子量、质量肽谱、氨基酸组成及+端、H段序列等均与理论

2、值一致，二硫键位置正确。0EGH7单用或与0EI1HG7合用，对猴外周血造血祖细胞有明显的动员作用。关键词干细胞因子，基因表达，造血生长因子中图分类号>:3#文献标识码J文章编号!%%%1&%#（!$%%&）%#1%#"31%:干细胞因子（GK-.H-))78FK(0，GH7）是一种重要的扩增，并且与其它造血生长因子如I1HG7、IO1的造血生长因子，它是!""%年分别由L=))=8.ML，HG7、

3、因F1R=K产物的一个胞外生障碍性贫血等的血液病的治疗上具有良好的应用［3Q!%］配体。根据其刺激细胞生长、结合受体特性分别被前景。我们应用基因工程构建了表达0EGH7的称为干细胞因子（GK-.H-))78FK(0）、GK--)因子（GK--)工程菌，制备了0EGH7，并对其结构与生物功能进行78FK(0）、R=K配体（N=KS=@8?T）等。EGH7有膜型和可溶了研究。型两种活性形式，膜型GH7由胞外区、疏水跨膜区!材料和方法和胞内区三部分组成，可溶型的GH7是膜型GH7在!#;U!#2位经蛋白酶促降解而成的，它包含了膜型!"!重组人干细胞因子制备GH7胞外区的主要部分。EGH7含有+1连、

4、V1连糖!"!"!工程菌株：3*0(,#MP;!（YOI#%2），表达载体基，但大肠杆菌表达的非糖基化EGH7具有生物活为YZ’$$%，由XSX[1HW3;:启动子控制人工合成的［!!］性，说明糖基对其生物活性影响不大。在生理状态EGH7基因表达，本所赵志虎博士构建。下，GH7的活性形式为非共价的二聚体，当GH7与其!"!"#工程菌培养：挑单菌落于;%.SSZ培养基酪氨酸激酶受体NW5作用时，双价的GH7先以其一中，摇床&%!;%0U.=?培养!%]!$E，按%^$_（4U个结合位点与NW5结合，诱导NW5构型发生改变，产4）接种量将上述活化菌种接!;只装有!%%.SSZ生内源二聚体化位点，

5、引起NW5的二聚体化，双价的种子摇瓶，摇床&%!;%0U.=?培养!%]!$E，按GH7的另一个结合位点与二聚体化NW5的另一个位;_（4U4）接种&%S发酵罐，&%培养#E，2$诱点结合，稳定了NW5二聚体，NW5的二聚体化激活了导#E，离心收集菌体。其酪氨酸激酶活性，从而引发一系列的级联反应。!"!"$重组人干细胞因子纯化：菌体以!‘!（%5U4）GH7主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时的体积用缓冲液稀释后超声破菌，离心收集包涵体，对晚期成熟血细胞也有作用。它能刺激造血祖细胞用3.()US尿素变性后，稀释复性。复性液经阴离子收稿日期：$%%&1%21%2，修回日期：$%%&1%3

6、1!&。基金项目：国家“八六三”高技术重大专项基金资助（+(*4!31%&1&%）。"北京昭衍新药研究中心。""通讯作者。5-)6789：3#1!%133$:$;#&；<1.8=)：>=?@AB?.8CD(EB*F(.M期吴军等：重组人干细胞因子的研究M77交换层析、疏水层析和反相层析纯化，及离子交换脱/)!G=33，再培养*"后，加入/)2#C#+)!G，溶解溶剂，获得纯化的!"#$%。后在酶联仪上测!。*L)!"#$%&’%()分析!"0"#人骨髓$%Y9D=培养法：取外科手术截下的&’()*)高压液相色谱仪，$+柱（,--./*)人正常肋骨，用Z’=<(M,)培养液冲出骨髓细胞，用--，

7、中科院大连化学物理所），0：含)1(23%0的纯比重为(1)LL的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，水；4：含)1(23%0的色谱纯乙腈（天津四友公司），计数细胞数。培养体系包括Z’=<(M,)培养液、马血梯度洗脱：)!*)-56，0())2!()2，4)2!7)2。清（H)2）、琼脂（)1/*2）、各种浓度的细胞因子（(X!"*分子量分析/))6F>-G的!"#$%、(X/))6F>-G的!"#$%