重组人干细胞因子工艺研究

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1、重组人干细胞因子工艺研究专业班级姓名学号摘要人干细胞因子(Humanstemcellfactor,hSCF)是一种重要的造血细胞因子，该文章在重组hSCFZ程菌的基础上，通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP—SepharoseFF>Source30RPC与Q—SepharoseFF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子，建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺。关键词组人干细胞因子包涵体复性分离与纯化生物学活性分离纯化工艺人干细胞因子(Humanstemcellfactor,hSCF)又称为肥大细胞生长因子(mastcellgrosVIhfac

2、toLMGF)>kit配体(kitligand,KL)及steel因子(steelfactoLSL),为c・kit原癌基因编码受体的配体蛋白，是自1990年发现的一种重要的细胞因子。它能够刺激早期造血干细胞及祖细胞增值，是造血干细胞增值分化的关键因子［lLhSCF能刺激造血细胞的生长、增生与分化。它可以与其它造血因子共同发挥作用，如与白细胞介素-3(IL-3)>白细胞介素・6(IL・6)、集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)等表现出较强的协同效应，临床上SCF可用于治疗一系列原发性或继发性的(因毒性、辐射免疫损伤造成的)以髓细胞亚群数目减少为特征的干细胞功能异常等

3、类型的疾病【2~4】。具有广阔的应用前景和药用开发价值。正是由于SCF具有广阔的应用前景，所以对它的需求也很大，但是其天然来源有限，成熟型可溶性SCF(SCF165)在人体或动物体内含量甚微，在血中的浓度为3.3ng/mL,故不可能从天然组织中分离纯化足够量的样品进行实验室和临床应用研究【5】。大量实验证明，人SCF的糖基化对其活性不是必需的，如此就可以用基因工程方法，使用大肠杆菌等表达体系来生产重组人SCF(rhSCF),以此來解决这个难题【6】。国内外多家研究单位或生物制药公司已从多方面开展重组人干细胞因了的开发与研制目前在美国主要有两家公司(Amgen和Immunex公司)

4、从事rhSCF的研制，其中Amgen公司采用人肠杆菌表达系统，而Immunex公司主要采用酵母表达体系。Amgen公司产品于1994年己基本完成临床I、II期研究，于1997年完成临床III期研究，并通过FDA的审批。现在rhSCF已在澳大利亚和加拿大限制性地上市。国内军事医学科学院生物工程研究所采用rhSCF制备工艺，经过rhSCF包涵体复性，DEAE阴离子交换层析吸附、浓缩，再经S-200凝胶层析和疏水层析，最后利用G・25脱盐柱得到rhSCF样品，其生产工艺采用四步柱层析，工作量大，得率相对较低。因此应加快这方面的研究，冇望在不远的将來，使我国的基因工程新药产品中能够增加r

5、hSCF新成员【12】。1、SCF的生物学功能【5】(1)>SCF的结构与物化性质：天然干细胞因子是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，共有273个氨基酸，既有N・糖基化，又有0■糖基化位点，相对分子质量为31,000-36,000,由非共价结合的两个相同亚基组成，等电点(PI)为3.8,含有5个半胱氨酸残基，形成两对二硫键(cys4-cys39和Cys43-Cysl33)o非糖基化的SCF分子量为18,000o鼠与人的SCF有83%的同源性【13】。SCF在小鼠由10号染色体Steel位点编码,在人位于IOq22・24。SCF的两种存在形式，一种为可溶性，即SCF可被

6、分泌到细胞外的条件培养液屮；另一种为膜结合形式，两种形式均有生物学活性。鼠和人SCF对人造血细胞几乎有相等的生物学活性，但对鼠细胞，鼠SCF比人SCF生物学效应强800倍【14】。(1)、SCF的牛物学活性：重组SCF和天然SCF有着相同生物学活性。SCF独自不能促使造血祖细胞的分化，但能够增强造血细胞的增殖潜能，可能是SCF激活最早期的多能造血干细胞，所以表现为对各种造血调控因子的协同作用[15-16]02、重组人干细胞因子的生产工艺要对重组人干细胞因了(recombinanthumanstemcellfactor.rhSCF)的牛产工艺进行研究，包括重组大肠杆菌的培养基、摇瓶

7、培养条件和发酵罐间歇培养的发酵生产，以及目标蛋白的分离纯化。(1)、发酵培养基通过摇瓶发酵对用大肠杆菌(EcDfj)DH5o/pBV220生产rhSCF的发酵培养基进行了研究。首先从几种常用的培养基中筛选出M9培养基是最适合工程菌生长和rhSCF表达的培养基，然后乂采用单因子实验方法对M9培养基中的碳源和氮源进行了逐个筛选，结果表明，最适合工程菌DH5o/pBv220生长的碳源为葡萄糖，氮源为蛋口月东和酵母粉，最后设计止交试验，对培养基配方进行了优化，确定出较适合的培养基，同时在