重组人干细胞因子的表达、复性、纯化及其对脐带血体外扩增作用研究

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1、硕士学位论文学校代码：10023学-I,JI：$2009570重组人干细胞因子的表达、复性、纯化及其对脐带血体外扩增作用研究所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成曰期：苏州方舟生物医药研发中心范洁丁欣欣丁欣欣蒋永平药理学细胞因子产业化及临床应用2012—3．28中国医学科学院&北京协和医学院硕士研究生毕业论文摘要一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一2ABSTRACT一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一3前言一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一5日U舌一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一实验材

2、料和方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一9二实验结果与分析一一一一一一一一一一一一一一一一一一--21三讨论一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一32小结一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一34参考文献一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一35论文综j苤一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一38附录一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一50致谢一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一62研究生简历一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一63独创性声明及学位论文版权使用授权书⋯⋯⋯一一6

3、4中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文摘要目的：通过大肠杆菌原核表达系统，由包涵体经纯化复性后获取重组人干细胞因子(recombinanthumanstemcellfactor，rhSCF)蛋白，同时制备相应的单克隆抗体，以新鲜脐血中分离的单核细胞(mononuclearcell，MNC)对SCF及其单抗的活性进行检测。方法：通过大肠杆菌表达系统，经IPTG诱导表达获取SCF包涵体，经透析复性，CM．Sepharose纯化后获得蛋白。用Ficoll密度梯度离心法从脐带血中提取MNC，利用免疫磁珠分选法(magneticcellsorting，MACS)分选

4、其中具有CD34+抗原表位的细胞，根据之前实验结果，使用一定浓度的血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、FLT-3配体(FLT-3ligand，FL)及实验获取的重组人干细胞因子(rhSCF)组合对脐带血进行七天体外扩增以检测rhSCF生物活性。制备筛选得到高滴度单克隆细胞株，使用该单克隆抗体通过脐带血体外扩增观察该单抗对rhSCF生物活性的抑制作用。培养七天后通过流式细胞术检测CD34+阳性细胞比例。使用肽图分析对rhSCF进行结构和功能研究。结果：成功使用IPTG在大肠杆菌BL21诱导表达rhSCF蛋白，包涵体经复性及CM—Sepharose纯化获

5、得高纯度的rhSCF蛋白。筛选获得高滴度的rhSCF单克隆抗体细胞株23C8。干细胞体外扩增实验表明rhSCF蛋白FL及TPO联用，具有协同刺激CD34+细胞体外扩增的作用；单克隆抗体23C8可以特异性的抑制rhSCF促进干细胞体外扩增的生物活性。肽图分析结果表明，rhSCF的活性位点位于第93—165位氨基酸序列中。结论：成功建立rhSCF原核表达、复性和纯化体系。rhSCF蛋白具有良好生物学活性，与同类标准品相比无明显差异；获得可分泌高滴度单克隆抗体的23C8单克隆细胞株；实验表明单克隆抗体23C8的结构域可结合rhSCF的生物活性位点，能特异性抑制rhSCF的活

6、性，阻止CD34+细胞体外扩增。rhSCF同MAb结合的活性位点位于第93．165位氨基酸序列中。该课题为造血干／祖细胞体外扩增体系的优化研究奠定了基础。同时为该细胞因子的临床应用提供了有价值的参考。【关键词】重组人干细胞因子；原核表达；单克隆抗体；脐带血体外扩增中国医学科学院&JL京协和医学院硕士研究生毕业论文Expression，refolding，andpurificationofrecombinanthumanstemcellfactoranddeterminationofitseffectonexvivoexpansionofcordbloodAbstrac

7、tobjectives：1toobtainrecombinanthumanstemcellfactor(rhSCF)proteinusinganE．coliexpressionsystem，andtostudythebiologicalactivityofrhSCFonexvivoexpansionofcordblood；2)toobtainaspecificmonoclonalantibody(MAb)torhSCFandtodeterminetheeffectsoftheantibodyonthebiologicalactivityofrhSCF