重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子的摇瓶发酵研究

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1、重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子的摇瓶发酵研究马莉，白泉，王骊丽，斯琴，耿信笃（西北大学现代分离科学研究所/现代分离科学陕西省重点实验室，陕西西安710069）摘要：为了优化重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子摇瓶发酵工艺，利用摇瓶法选择出最佳的rhGM-CSF的培养条件。结果表明：最佳条件为培养温度32℃，初始pH值7.2~7.4，摇床转速200r/min，种子菌龄在OD600为1.0左右时接种，并在对数生长前期0.5~0.8之间诱导4h。在此优化的培养条件下，在摇瓶中使用M9培养基时，rhGM-CS

2、F的表达量占菌体总蛋白的24.3%，OD600达5.35，说明构建的rhGM-CSF工程菌发酵的稳定性和重复性良好，可为rhGM-CSF的大规模生产提供可靠的放大依据。关键词：重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；大肠杆菌；摇瓶发酵中图分类号：TQ920.6文献标识码：A文章编号：1000-274X(2004)0117-08人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(humangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF)是一种重要的造血调控因子[1]

3、，对各种原因尤其是癌症患者化疗后引起的白细胞减少症有明显的疗效。由于天然人GM-CSF来源有限，产量甚微，不能满足科研和临床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSFcDNA，并实现了表达[2],1993年张智清等人在国内首次克隆了人GM-CSFcDNA，并在大肠杆菌中获得表达[3]。近年来，许多科研人员也致力于这方面的研究，并取得了成功[4~6]。本文作者也克隆出了人GM-CSFcDNA，实现了在大肠杆菌中的表达。为了进一步开发研究，实现rhGM-CSF的产业化，本文以提高其表达量和细胞产

4、量为目标，对重组大肠杆菌的摇瓶培养条件进行了研究，确定出最佳生产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养条件，为以后的大规模发酵生产奠定基础。1材料和方法1.1材料工程菌：菌种pDH/rhGM-CSF/DH5a，由本所分子生物学实验室构建。试剂：酵母粉（Yeastextract，OXOID公司产品），蛋白胨（Tryptone，OXOID公司产品），琼脂糖（Agarpowder，日本进口分装公司，上海化学试剂站分装厂），氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化铵均为分析纯。1.2

5、方法1.2.1一级种子的制备选用LB培养基，其组成（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，氨苄青霉素0.1，pH调至7.0，1.034×105Pa高压灭菌20min。将种子接入其中后，于30℃，200r/min8的摇床内培养过夜，OD600达1.0左右时即可进行转接。1.2.2发酵培养选用M9培养基，其组成（g/L）：胰蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，Na2HPO4×12H2O17.1，KH2PO43.0，NaCl0.5，NH4Cl1.0，氨苄青霉素0.1，pH调至7

6、.2，1.034×105Pa高压灭菌20min。1.2.3菌体密度的测定用721型分光光度计在600nm波长下测定OD600值。1.2.4表达量的测定取500mL发酵液离心，弃上清液，向菌体中加样品缓冲液。其组成为50mmol/LTris-HCl（pH6.8），50mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝和10%甘油，然后搅拌均匀，沸水煮5min，离心。走SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，用Cs-930双波长扫描仪（Shimadzu）扫描测定rhGM-CSF表达量。2结果与讨论2.

7、1培养温度对工程菌生长的影响微生物的生长和产物合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。本实验中选择培养温度27、30、32、35°C进行考察，实验结果见图1。■27℃,●30℃,×32℃,▲35℃图1培养温度对重组大肠杆菌生长情况的影响Fig.1Effectofculturetemperatureonthethegrowthofbacteria从图1可看出，在27、30和32°C培养时菌体密度均能达到5.00，但在32°C时为最高。其原

8、因是在较低温度(如27°C)进行培养时细菌的生长代谢缓慢，菌体不能得到充分的增殖，而在较高温度(如35°C)进行培养时，虽然生长迅速，但代谢加快，生产期提前，对葡萄糖的利用过多，排谢出大量的代谢副产物（如乙酸等），抑制了菌体的生长，因而菌体密度较低[7]。所以，以下实验均控制培养温度在30～32°C。2.2诱导时机对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响基因工程菌的两阶段培养法是为了在扩大菌体密度的同时，尽可能提高工程菌的表达水平，因此诱导时机是至关重要的因素，在研究