中国汉族hla-cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用

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1、中山大学博士学位论文中国汉族HLA-Cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用姓名：邓志辉申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：徐安龙20090910中山大学博士论文：中国汉族HLA．Cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用中国汉族HLA—Cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用专业：生化与分子生物学博士研究生：邓志辉导师：徐安龙教授摘要经典的HLA-Cw分子不仅呈递内源性抗原，而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KillerImmunoglobulin-likeReceptor,KIR)的配体，在调节NK细胞(NaturalKillercel

2、ls)的杀伤功能中起重要作用。随着HLA．Cw分子生物学功能、HLA—Cw基因与疾病，以及HLA-Cw基因与移植相关性等研究的开展和深入，人们对肌A-Cw基因的传统错误认识被逐渐打破。当前HLA-Cw等位基因多样性、全长序列SNPs多态性及表达调控的基础和应用研究正悄然升起。为此，我们进行如二A．Cw等位基因多样性、全长序列SNPs遗传多样的研究，基于所获取的全长序列，建立可靠的、适合于中国人群的高通量化HLA-Cw基因测序分型方法，该方法可用于骨髓库造血干细胞的HLA入库数据常规检测、中国人群HLA．Cw基因群体遗传学和组织配型等相关的研究和应用工作。H

3、LA-Cw等位基因多样性研究，本文首先对100份新疆维吾尔族随机个体的血样进行了HLA-Cw基因的第2和第3外显子测序分型，排除罕见等位基因后，出现模棱两可结果的比例占37％。共检出了27种等位基因，其中频率大于10％的2种常见等位基因为Cw*0602和Cw*0102。按与KIR分子识别方式的不同，第1组Cw木01，03，07，08，12，14和第2组Cw*02，04，05，06，15，16，17，18的频率IV中山大学博士论文：中国汉族HLA．Cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用分别为0．61和0．40，其频率的分布不同于汉族人群。我们在后来增加的2

4、9份维吾尔族随机捐血者样本检测时，检出了一个Cw*040105新等位基因。其次是调查汉族人群HLA-Cw基因的分子遗传多态性，筛选、发现和鉴定可能的HLA新等位基因，探讨商品化试剂盒的PCR引物、测序引物与中国人群的匹配性，将所获得的HLA-Cw基因测序分型结果供骨髓移植患者查询和检索。共对734份汉族骨髓志愿捐献者样本采用AtriaAlleleSEQRHLA-CwPlus商品化试剂盒进行HLA-Cw基因第2、第3和第4外显子测序分型，共检出了41种等位基因，频率大于10％的3种常见等位基因为：Cw*0102>Cw*0702>Cw*0304，基因的多样性(

5、DP)达0．9281，实际观察杂合度(H)为0．9196(675／734)，纯合子样本比例占8．04％，表明汉族人群HLA-Cw基因为高度多态性位点。汉族HLA-Cw分子第1组Cw*01，03，07，08，12，14与第2组Cw*02，04，05，06，15，16，17，18组的频率分别为0．8243和O．1758，与KIR识别以HLA-Cw分子第1组为主。734份汉族个体经AtriaAUeleSEQRHLA-CwPlus商品化试剂盒检出了8例PCRoSBT结果“异常”的样本，经分子克隆和单倍体测序，在1个样本中检出了Cw*0624新等位基因，另外的2个无

6、关个体样本中均检出了Cw*075602新等位基因。其余的5例样本经分子克隆测序以及自行设计的PCR引物再测序，证实了这5例标本用Atria商品化试剂盒初次检测结果中，均存在Cw*0706等位基因漏检和丢失现象，未检出新等位基因。我们总结了这5例样本等位基因漏检和丢失的一般特点，阐明等位基因丢失的原因。这5例样本等位基因漏检和丢失现象提示：对HLA-Cw分子进行全长序列测定，在丰富和增加国际IMGT／HLADatabase数据库中国人群HLA-Cw基因全长序列等基础数据的同时，建立适合于中国人群的测序分型方法十分必要。为此，我们采用长距离PCR技术和Pfu酶

7、，扩增HLA-Cw基因的全长目的全长序列片段4．5kb，同时设计了12条测序引物进行全长序列双向测序。对28个汉族个体样本，我们共检测出22种等位基因，均向GenBank递交序列；其中Cw*0706，Cw*030301，Cw*140201的全长序列为首次报道，尤其是Cw*0706内V中山大学博士论文：中国汉族HLA．Cw基因多态性及测序分型技术的研究与应用含子序列的获得，使得我们能够重新设计对该等位基因测序分型的引物，解决Atria商品化测序分型试剂盒对这一等位基因漏检的问题。利用群体遗传学分析方法，将所得HLA-Cw56条序列用clustal软件进行序列

8、排比，输入到DnaSP4．0进行多态性分析，共发现244个SNPs