基因测序技术的优缺点及应用

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1、基因测序技术的优缺点及应用ok3ina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generationsequencing,NGS)的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009年3月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着

2、NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年,《Nature》发表了采用NGS技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《NatGe》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后,通过NGS技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS技术已成为里程碑式的进步。2010年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病

3、和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。1、第一代测序1.1Sanger测序采用的是直接测序法。1977年,Freder

4、ickSanger等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001年,AllanMaxam和orton等提出优势对数记分法(logoddsscoremethod,LOD),主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。LOD值为正,支持连锁;LOD值为负,则否定连锁。通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的LOD值,可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度,从而确定该基因在染色体上的粗略位置。然后利用该区域的染色体基因图谱,分析定位区域内所有基因的功能与表达,选择合适的候选基因进行突

5、变检测,最终将致病基因定位或克隆。然而,采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。不但所需遗传样本量较大,一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样,而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确(一般只能定位在染色体某一区间),这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。目前,连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用,但经典的间接测序方法,如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰,而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。2、新一代测序(NGS)主要包括全基因组重测序(

6、esequencing,之间,不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。NGS的测序过程主要包括DNA测序文库的制备、锚定桥接、PCR扩增、单碱基延伸测序和数据分析。研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段,经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对,最终确定是否为突变基因。自NGS技术问世以来,利用WES在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。这些成果不仅集中在单基因遗传疾病,还在多基因影响的

7、复杂疾病中获得大量相关基因的发现。在单基因遗传性疾病中,如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。在一些罕见的疾病中,如Kabuki综合征、家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发现新的致病基因。同时,在小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、脑皮质发育不良等复杂疾病的研究中也取得丰硕成果。