病理基因测序技术及临床应用【临床医学毕业论文设计】

《病理基因测序技术及临床应用【临床医学毕业论文设计】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、临床医学论文•病理基因测序技术及临床应用【摘要】目的:应用基因测序仪对肿瘤及相关疾病进行临床病理基因直接测序,以指导医疗保健、疾病预防、基因治疗。方法：石蜡组织、血液标本提取DNA，经凝胶成像及核酸定量仪定量、定性，设计相应的引物及购买测序试剂盒，经PCR扩增后进行基因测序，通过SeqScap软件诊断分析测序结果，并对阳性结果做反向测序证实。结果：石蜡组织标本DNA提取成功率80%，总提取成功率90%以上，在此基础上的PCR扩增、纯化及测序成功率达99%。测序基线平整，平均信号强度在200-1000之间，噪音＜5，Raw基线接近0。预报分子靶向约物治疗有效率及

2、无效率均达100%。结论：临床病理基因测序是癌症基因组计划的核心内容，基因测序技术可以快速准确地完成肿瘤基因序列分析，该技术重复率高、结果可靠、科学性强，是分子病理学发展的一个重要新领域。【关键词】基因测序；癌症基因组；SeqScap软件随着分子生物学技术的不断发展，基因诊断已受到广泛关注。我院2004年引进美国ABI3100Avant遗传分析仪及SeqScap测序诊断软件，根据GeneBank基因序列选择WHOPathology&Genelics列出的与疾病有重要意义的基因及其片段，使用测序仪测定靶基因的核昔酸序列，应用SeqScap软件自动诊断临床病理标本

3、。目前对肿瘤、癌前病变和心脑血管等多种疾病全面开展P53全基因组、Kras基因、BRCA1全基因组、Ckit基因、EGFR基因、APC基因、YMDD乙肝病毒耐药基因和AP0E基因多态性序列分析，并开始尝试与美国癌症基因组（TCGA）计划接轨。1材料与方法1.1材料所有材料均为临床快速冰冻送检组织、甲醛固定组织和心脑血管疾病及健康体检人群血液标本计890例，对照组织为非肿瘤切端或血液标本210例。1.2主要仪器与试剂美国ABI3100AvantGeneticAnalyzer遗传分析仪、ABIGeneAmpPCRSystem2700、Promega公司Al120基

4、因组DNA提取试剂盒'Qiagen公司HotStarTaqDNAPolymerase及ABIBigDyeTerminatorv3.1Kit测序试剂盒(Part.No4336917)。1.3方法1.3.1引物设计根据NCBI和WHO相关文献选择临床意义明确的候选日的基因，使用Oligo软件设计引物，由上海生物工程公司合成。其中，APOE基因引物特异性扩增其第4外显子区含编码112位与158位氨基酸序列，产物片段358bp。Kras基因引物扩增其第1外显子区，产物片段397bp。EGFR基因第18、19、21外显子，产物片段分别为437、411、399bp。Cki

5、f基因第11外显子的产物片段378bp、乙肝耐药基因(YMDD)产物片段338bp等。1.3.2基因组DNA提取及PCR扩增条件的建立取受检对象静脉血2ml，肝素抗凝处理，按说明书提取DNA-18°C保存备用。20n1PCR反应体系：10PCRBuffer(含15mMMgC12)2“1，HotStarTaqDNAPolymerase0.2“1，5QSolution4“1，dNTPmix(10mMofcach)2“1，上下游引物各1“1，模板DNA1n^Distilledwater8.8//I°PCR反应条件：95°C预变性15min，用TouchdownPC

6、R技术，94°C变性50see，63°C〜58°C退火1min（-0.5°C/min），72°C延伸1min，共循环10次；94°C变性50s，57°C退火1min，72°C延伸1min，循环30次，最后72°C延伸10min。1.3.3PCR产物纯化及测序用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，用Vgene公司PCR产物纯化试剂盒，过柱纯化后进行测序反应。10“1测序反应体系：1“1BigDye+1.5“1BigDyeSequencingBuffer+3“1上游弓

7、物+1[iPCR纯化产物+3.5[iddH2O°测序PCR热循环条件

8、：96°C，10s-（96°C10s^50°C5s-60°C4min）x25个循环-60°C，4min-4°C保温。测序反应产物纯化后（酒精/NaAc法），经95°C变性4min，迅速置冰水中冷却4min，上样至ABI3100Avant遗传分析仪进行毛细管电泳'在Datecollection2.0软件下运行并获取结果°1.3.4SeqScap软件自动诊断分析将测序结果用DNAsequencinganalysis5.1软件自动分析原始测序数据，获取测序电泳图和序列图，然后进入ScqScap软件自动诊断程序。图1AP0E基因E4/3基因型（略）图2P53基因C/T

9、杂合突变（略）图3EGFR基因（略）2