基因测序技术概述

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1、基因测序技术概述摘要：基因测序技术是一种发展迅速和应用广泛的现代分子生物学技术之一。本文基于国内外基因测序技术的发展现状，综合评述了四代基因测序技术，归纳了它们各自的特点与优缺点，以及应用现状、范围及其在实际应用中的优势和不足，总结了当前出现的基因测序新方法，并对该项技术的发展趋势进行展望。关键词：基因测序技术；发展；应用；前景Abstract:Genesequencingtechnologyisakindofmodernmolecularbiologytechniqueswithrapiddevelopmentandwi

2、deapplication.Inthispaper,itisbasedonthecurrentdevelopmentofgenesequencingtechnologyathomeandabroad,acomprehensivereviewisgivenonthefourgenerationsofgenesequencingtechnology,itsumsuptheirrespectivecharacteristics，advantagesanddisadvantages,aswellastheirapplication

3、aboutstatus,scopeanditsadvantagesanddisadvantagesinpracticalapplication,itsummarizesthenewgenesequencingmethod,andpointsoutthedevelopmenttrendofitself.Keywords:Genesequencingtechnology;Development;Application;Prospects9基因测序技术，又称DNA测序技术，是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物

4、学的发展成熟。该技术始于20世纪70年代中期。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。[1]同一时期，Sanger发明了双脱氧链终止法。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA 测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代基因测序技术。最近几年发展起来的第二代基因测序技术则使得DNA 测序进入了高通量、低成本的时代。目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定DNA 序列更快，并有望进一步降低测序成本。[2]第一代DNA测序技术包括传统的化学降解法、双脱氧链终止

5、法、基于Sanger原理而发展的荧光自动测序技术，以及杂交测序技术等[3]。随着人类基因组计划的完成，进入功能基因组时代后，传统的第一代测序技术不足以满足深度测序和重复测序等的需求，因而促进了新一代测序技术的发展。第二代测序平台包括454测序技术、Solexa技术和SOLID测序技术。第三代测序技术是在第二代测序基础上增加读长，提高了测序效率，降低了成本。三代主要是单分子测序，能直接对RNA和甲基化DNA序列进行测序[4]。第四代测序技术为纳米孔测序技术，具有长读长、高通量、低成本和短耗时的优势[5]。目前，四代测序技术在

6、各项研究领域中均有所应用，未来测序技术将会发挥更大的作用。1国内外基因测序技术1.1第一代测序技术1.1.1化学降解法1977年，Gilbert等提出了化学降解法。在该方法中，一个末端被放射性标记的DNA片段在五组相互独立的化学反应中分别被部分降解，其中每一组反应特定地针对某种碱基。因此生成五个特异性标记的分子，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段的位置。最后，各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。[6]化学降解法刚提出时，因准确性及

7、易掌握性使用比较广泛。而且化学降解法有一个独特的优点即用原DNA分子进行测序而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但由于操作复杂，之后被Sanger法所代替。1.1.2双脱氧链终止法双脱氧链终止法又称Sanger法，该方法的原理是：由于双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)的2'和3'都不含羟基，在DNA反应中不能合成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。[7]核酸模板在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷三磷酸（dNTP,其中的一种用放射性P32标记）存在条件下复制时，在四管反应系统中，分别按比例引入四种ddN

8、TP,因为双脱氧核苷没有3'-OH,所以只要双脱氧核苷渗入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影