《代基因测序技术》PPT课件

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1、新一代基因测序技术原理及其在医学中的应用新一代基因测序技术(NextGenerationSequencingTechnologies)是一系列在2004年后问世的新的DNA测序技术。这些新技术使用不同以往的化学测序法，依靠高度并行的基因序列读取方式，取得了令人难以置信的DNA测序高通量。新一代基因测序技术能在数天内完成第一代基因测序技术花费1O年完成的人类基因组测序。自2004年问世起，不断发展的新一代基因测序技术（NGS）在生物医学领域引发了许多突破性的发现，推动了基因组学的革命，促进新学科的创立，如个人基因组学，细菌基因组流行病学。基因测序技术起源与发展新一代基因测

2、序技术平台简介新一代基因测序技术的临床应用肿瘤分子诊断领域肿瘤研究领域遗传病筛查领域传染病研究领域细菌基因组流行病领域基因测序技术起源与发展20世纪70年代初期，分别在几个独立的实验室，以不同的方法实现了基因测序直到1977年，可靠的基因测序方法——Sanger测序法和Maxam—Gilbert测序法才问世Sanger测序法因为其试剂高效低毒，因而得到不断的改善，进一步发展成依靠染色的自动化分析基因测序法2001年，完成了第一个人类基因组序列图谱。该基因组序列图谱不仅可以帮助快速识别单个基因，而且为探索研究人类基因组的主要区域提供了便利Sanger测序法的局限性对常规D

3、NA测序来说太昂贵，太耗时。随着各种动植物基因组数据的大量产生，科学家开始专注于基因的个体多样性，并尝试用新的方法来描述个体的基因组由于成本和测序数据输出量的限制，用Sanger测序法获取不同个体的基因组进行大规模的对比研究是不可行的从2004年起，一系列新的DNA测序技术，名为“新一代基因测序技术”，不断得到开发，在生物医学领域引发了许多突破性的发现，并彻底改变了基因组测序领域的发展自动化Sanger方法被认为是“第一代”基因测序技术“新一代基因测序技术”(NextGenerationSequencingTechnologies，NGS)相对Sanger法，新一代基因

4、测序技术的主要优点是能够快速，低价地提供巨量的基因序列数据。它们每次测序运行能读取的碱基数高达百亿。可以代替生物晶片去对基因定性、定量分析。可以快速测序全基因组，大规模对比研究不同个体的基因组成为可能；2004年起开始面世的一系列新的DNA测序技术有统一的名称——“新一代基因测序技术”。事实上各种新一代基因测序技术的化学测序方法有着显著的不同，但是有3个共同特征：1.新一代基因测序技术都能够同时处理以百万计的基因序列读取，这也是它们能高通量地测序基因的原因。2.新一代基因测序技术通过PCR扩增创建它们的基因序列读取片段库，劳动强度大大低于传统的使用载体克隆的Sanger

5、测序。3.与自动化Sanger测序技术相比，新一代基因测序技术所产生的读长都比较短(35—700碱基)。NGS技术平台简介Roche(454)GSFLX基因测序技术首先对目标DNA的酶切短链进行油包水PCR扩增，然后以扩增的DNA酶切短链为模版来合成新的DNA。当对应的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成的DNA链上时，添加的荧光素酶能产生光。根据闪光次序以及对应加入的dNTP，测序仪所携带的软件就可以创建目标DNA模板的具体序列信息。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结

6、束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。诺贝尔奖得主FrederickSanger和WalterGilbertIllumina的GenomeAnalyzer测序技术对目标DNA的酶切短链进行扩增是通过桥式PCR来完成的。经过PCR扩增后，芯片上的目标DNA片段簇被用来做为模版来合成新的DNA链，四个差异化标记的荧光dNTP为每个目标DNA片段簇的复制提供原料。一旦单个dNTP被加入新合成DNA的末端，此dNTP的差异化标记荧光就会被读取并记录，由此实现边合成边测序。当DNA延伸步骤完成，测序仪所携带的电脑软

7、件程序就会分析每个目标DNA簇的序列，并完成各个短链序列的对齐，以及目标基因组的组合。近年来，Illumina公司在基因测序仪行业一直占据主导地位，其产品占据60％市场份额。2010年推出的IlluminaGA测序仪，HiSeq2000,就是一个标准高通量大规模平行基因测序的典范。HiSeq2000一次测序耗时为10天，能完成600亿个碱基对的测序，试剂成本仅为24000美元。Illumina公司在2011年推出的测序仪，MiSeq，针对较小的实验室和临床诊断市场，其数据输出量小于2010年推出的HiSeq200。BiosystemsSO