基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理).pdf

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1、测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddT

2、TP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起

3、第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：1）构建DNA测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2行column，每行column有60个tail，每个tail经C

4、CD镜头课捕获荧光信号。3）成簇（cluster）NGS的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到CCD镜头摄取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答2大难理解之处：一．可逆终止荧光dNTP(Illumina测序核心技术)荧光修饰dNTP可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区别碱基信号的功能），是Illumina测序的最核心技术。1.上图是修饰过的dCTP分子结构式，在核苷酸糖基的3'位连一个叠氮基团（红色基团）。这个叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合的作用（理解见下图DNA复制时的5’和3’的示意图，下一个碱基

5、合上时是：下一个核苷酸的5’P连接到上一个核苷酸的3’OH，故如果下一个核苷酸的3’带有叠氮基团而非自然状态下的OH时，下一个核苷酸就无法合上。）。2.叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二巯基丙醇），叠氮基团会发生断裂，并在原来的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复3’的-OH状态，以供下一个碱基合上。3.在碱基上，通过连接臂（蓝色基团）连接一个荧光基团。4种dNTP分别连4种不同颜色的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发

6、荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，再加入化学试剂[TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)]淬灭荧光信号,并用巯基试剂去除3'位阻断的叠氮基团，以便能进行下一轮的测序反应。注：每一步试剂具有极高的处理效率，因为在要重复几百次的反应中（30~40x测序），每步的得率差一点，最终的结果就会差许多，所谓的指数放大效应。缺点1）Prephasing：在边合成边测序过程中，每个循环应该合成一个碱基，因为某些原因，会一个循环合成二个或更

7、多的碱基，这种多合成碱基的情况就称为Prephasing。叠氮基团在常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，是导致测序时的Prephase的主要原因。Prephasing越严重，则测长越短（因为多个1个循环只记录1个碱基，如果1个循环中同时合上了多个碱基，则势必相对长度缩短）。Prephasing占了Illumina测序长度中几乎一半的限制性因素。（叠氮基团在常温下不是很稳定，Illumina的测序SBS试剂都要低温保存。Illumina的新型测序仪（HiSeq/NextSeq/MiSeq等）的内部还内置了一个小冰箱，来给