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1、病理基因测序技术及临床应用【摘要】目的：应用基因测序仪对肿瘤及相关疾病进行临床病理基因直接测序，以指导医疗保健、疾病预防、基因治疗。方法：石蜡组织、血液标本提取DNA,经凝胶成像及核酸定量仪定量、定性，设计相应的引物及购买测序试剂盒，经PCR扩增后进行基因测序，通过SeqScap软件诊断分析测序结果，并对阳性结果做反向测序证实。结果：石蜡组织标本DNA提取成功率80%，总提取成功率90%以上，在此基础上的PCR扩增、纯化及测序成功率达99%。测序基线平整，平均信号强度在200~1000之间，噪音<5,
2、Raw基线接近0。预报分子靶向药物治疗有效率及无效率均达100%。结论：临床病理基因测序是癌症基因组计划的核心内容，基因测序技术可以快速准确地完成肿瘤基因序列分析，该技术重复率高、结果可靠、科学性强，是分子病理学发展的一个重要新领域。【关键词】基因测序；癌症基因组；SeqScap软件随着分子生物学技术的不断发展，基因诊断已受到广泛关注。我院2004年引进美国ABI3100Avant遗传分析仪及SeqScap测序诊断软件，根据GeneBank基因序列选择WHOPathology&Genetics列出的与疾病有
3、重要意义的基因及其片段，使用测序仪测定靶基因的核昔酸序列，应用SeqScap软件自动诊断临床病理标本。目前对肿瘤、癌前病变和心脑血管等多种疾病全面开展P53全基因组、Kras基因、BRCA1全基因组、Ckit基因、EGFR基因、APC基因、YMDD乙肝病毒耐药基因和APOE基因多态性序列分析，并开始尝试与美国癌症基因组(TCGA)计划接轨。1材料与方法1.1材料所有材料均为临床快速冰冻送检组织、甲醛固定组织和心脑血管疾病及健康体检人群血液标本计890例，对照组织为非肿瘤切端或血液标本210例。1.2主要仪器
4、与试剂美国ABI3100AvantGeneticAnalyzer遗传分析仪、ABIGeneAmpPCRSystem2700、Promega公司A1120基因组DNA提取试剂盒、Qiagen公司HotStarTaqDNAPolymerase及ABIBigDyeTerminatorv3.1Kit测序试剂盒(Part.No4336917)。1.3方法1.3.1引物设计根据NCBI和WHO相关文献选择临床意义明确的候选目的基因，使用Oligo软件设计引物，由上海生物工程公司合成。其中,APOE基因引物特异性扩增其第
5、4外显子区含编码112位与158位氨基酸序列，产物片段358bp。Kras基因引物扩增其第1外显子区，产物片段397bp。EGFR基因第18、19、21外显子，产物片段分别为437、411、399bpoCkit基因第11外显子的产物片段378bp、乙肝耐药基因(YMDD)产物片段338bp等。1.3.2基因组DNA提取及PCR扩增条件的建立取受检对象静脉血2ml,肝素抗凝处理，按说明书提取DNA,-18°C保存备用。20n1PCR反应体系：10PCRBuffer(含15mMMgC12)2p1,HotStar
6、TaqDNAPolymerase0.2jli1,5QSolution4y1,dNTPmix(10mMofeach)2uh上下游引物各1nL模板DNA11,Distilledwater8.8pLPCR反应条件：95°C预变性15min,用TouchdownPCR技术，94°C变性50sec,63OC_58°C退火1min(-0.5°C/min),72°C延伸1min,共循环10次；94°C变性50s,57°C退火1min,72°C延伸1min,循环30次，最后72°C延伸10mine1.3.3PCR产物纯化及
7、测序用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，用Vgene公司PCR产物纯化试剂盒，过柱纯化后进行测序反应。10m1测序反应体系：1M1BigDye+1.5p1BigDyeSequencingBuffer+3yl上游引物+1卩1PCR纯化产物+3.5u1ddH20o测序PCR热循环条件：96°C,10sT(96°C10s-50°C5s-60°C4min)x25个循环-60°C,4min-4°C保温。测序反应产物纯化后(酒精/NaAc法),经95°C变性4min,迅速置冰水中冷却4min,
8、上样至ABI3100Avant遗传分析仪进行毛细管电泳，在Datecollection2.0软件下运行并获取结果。1.3.4SeqScap软件自动诊断分析将测序结果用DNAsequencinganalysis5.1软件自动分析原始测序数据，获取测序电泳图和序列图，然后进入SeqScap软件自动诊断程序。图1APOE基因E4/3基因型（略）图2P53基因C/T杂合突变（略）图3EGFR基因（略）2结果与讨论石蜡组织
