失血性休克大鼠海马中hsp70的表达及死后稳定性研究

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文失血性休克大鼠海马中HSP70表达及死后稳定性研究．▲上—JL_刖舌休克是机体在严重失血失液、感染、创伤等强烈致病因素作用下，有效循环血量急剧减少，组织血液灌流量严重不足，导致各重要生命器官和细胞的功能代谢障碍及结构损害的全身性病理过程【I_】。其中失血性休克死亡是交通事故、医疗责任事故以及刑事犯罪中一个常见的原因。一般在15分钟内快速大量失血超过总血量的20％左右(约1000m1)时即可引起失血性休克，如果失血不能得到有效控制，失血量超过总血量的50％，会很快导致死亡。目前对于失血

2、性休克的研究，多集中于失血性休克的补液治疗及缺血．再灌注损伤机制方面，对失血性休克出血至死亡所经历时间的推断，则报道甚少。有研究表明，失血性休克存活持续2小时以上者，心肌肌红蛋白和钙调蛋白明显缺失f3’训。但由于未经有效治疗的失血性休克伤者多在2小时内死亡【5】，且现实中遇到的失血性休克，因出血部位、程度、伤者的个体差异以及救治时间的不同，存活时间均不相同。因此，至今对失血性休克发生后伤者存活时间的推断，仍没有一个公认的标准，也成为法医病理学上的一大难题。热休克蛋白(heatshockprotein，HSP)因R

3、itossa和Tissieres最先发现它在热休克诱导的果蝇染色体中合成而得名，HSP按分子量大小可分为几个家族，其中HSP70(66．78kD)家族是HSP中最保守和最主要的一类，在细胞应激后(如缺血、缺氧等)合成最为显著16J。HSP70及其部分相关基因在人类定位于6、14、21号等位染色体上。人类HSP70基因由2440个核苷酸组成，不含内含子，其中57端、37端分别含有非编码的212与242个核苷酸序列，57端上游是TATA盒，30个核苷酸处有一个转录所必需的大约20bp的特异核苷酸序Yt(57．CT-G

4、AA．TTC．AG．3’)，即热休克元件(heatshockelement，HSE)，HSE则与HSP70的表达有关¨】。热休克等应激状态下热休克转录因子(heatshocktranscriptionfactor，HSTF)被激活，通过结合到HSP70基因的HSE区域，特异地诱导HSP70基因转录【8’91。HSP70蛋白的三级结构由一个连接有球型单位(globularunit)的p层(13sheet)年l0【7重庆医科大学硕士研究生学位论文螺旋管(a-helicaltube)组成，其中球型单位是ATPase区(

5、1—386aa，44kD)、13层和0L螺旋管则是肽结合区(384．543aa，18kD)。HSP70家族包括HSP72，HSP73，HSP75和HSP78。HSP72在应激状态下迅速合成，而在正常条件下不表达或少见合成，通常又被称为诱导型HSP70，简称为HSP70；其它的为结构型，固定表达于非应激的正常细胞的胞浆、细胞器、细胞核中【10】。HSP70在各种应激原作用下均能被诱导，其诱导水平与应激原浓度和持续时间有关。HSP70除了具有分子伴侣【111、提高细胞耐热性㈣等功能外，也通过调节特殊蛋白的活性或修复细

6、胞功能起到抗凋亡作用【Ⅻ。HSP70作为缺血缺氧所诱导的一种细胞保护性物质而日益受到医学界的广泛关注。本研究通过建立大鼠失血性休克模型，在不同时间点对大鼠海马组织取材，并以脑外伤组、假手术组和正常组作为对照，运用免疫组织化学方法检测蛋白的动态变化，并对其死后稳定性进行研究，以此来推断失血性休克后存活时间，探讨其发生机制及在法医学上的意义。8重庆医科大学硕士研究生学位论文1材料与方法1．1动物及分组健康SD大鼠105只，体重(230±30)g，雌雄不限(由重庆医科大学实验动物中心提供)，随机分为正常组(5只)、假手

7、术组(5只)、创伤对照组(25只)、失血性休克组(25只)、死后稳定性组(45只)。其中创伤对照组与失血性休克组各分为5个亚组，即创伤／休克0、0．5、l、1．5、2小时组；死后稳定性组分为9个亚组，即死后6、12小时、1、2、3、4、5、6、7天组；每个亚组均5只大鼠。1．2主要仪器TSJ．Q型全自动封闭式组织脱水机(常少H市中威电子仪器厂)石蜡切片机(LeicaRM2135型，德国)WZ．ZA微量振荡器(北京海淀电子医疗仪器厂)水浴恒温箱(北京长源实验设备厂)CSl01．2型电热鼓风干燥箱(重庆实验设备厂)光

8、学显微镜(Olympus)显微图像采集系统(Olympus—Bx51)病理组织包埋机(BMZ．III，国产)BL．410生物实验系统(泰盟科技)牙科钻(佛山市中熙医疗器材有限公司)SimplePCI图像分析系统(Compix公司，美国)1．3主要试剂苏木素(上海化学试剂厂)伊红(上海试剂三厂)无水乙醇(重庆东方试剂厂)二甲苯(上海化学试剂总厂)APES防脱片剂(博士德生物