大鼠脑外伤后bdnf的表达及死后稳定性的实验研究

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文的功效【21。在海马结构中，BDNFmRNA在对损伤相对耐受的齿状回、皮层及海马CA2区表达增加明显，而在CAl区则无表达增加。脑损伤后BDNFmRNA表达的调节只在特定的细胞群产生，说明各个脑区神经元调节BDNFmRNA表达的潜力不同。最近的研究认为基因的改变可以影响BDNF的表达，通过改变Val66等位基因，可以增强BDNF的表达功能，有利于脑损伤的恢复13J。也有部分报道在外周神经损伤后，BDNF的表达出现增加。BDNF对神经损伤的保护作用主要是削弱因为细胞毒素、自由基、缺氧或外

2、伤等相关因素所启动的脑损伤。其机制可能包括自由基代谢以及对钙平衡的维持等。14．5]BDNF与其受体在细胞分布上的一致性表达上调可抵御神经元损伤，而降低BDNF的表达，则会减弱神经元对损伤的抵抗，并降低受损神经元自我修复、增生，移行的功能。同时BDNF的表达受多种内部和外部因素的影响，与损伤程度和损伤时间具有一定的量效关系。同等程度损伤后，各脑区BDNFmRNA表达到最大量的时间不同，而不同程度的损伤，在相同的时间点BDNF的表达量也不一样。GriesbachGS等在对大鼠冲击性脑损伤模型研究中发现，大脑海马回的B

3、DNF的表达量与损伤程度和损伤时间具有相关性。但至今国内外文献尚未见有采用外伤性脑损伤模型来研究BDNF表达量的变化与时间的关系及BDNF在死后的稳定性。我们在本课题的研究中，采用自由落体硬膜外撞击动物模型，结合常规的HE和免疫组织化学技术，对脑外伤后损伤周围不同时间段BDNF表达变化规律，及其在．20℃环境下保存的稳定性进行了研究，探讨外伤性脑损伤后BDNF对神经细胞的保护作用及其机理，以期为临床上外伤性脑损伤的治疗提供一些理论依据，为法医学上损伤时间的推断和颅脑损伤鉴定及生前伤死后伤的鉴别提供一种新的指标。1材

4、料与方法1．1材料健康SD大鼠105只，体重(240+30)g，雌雄不限(由重庆医科大学实验动物中心提供)，随机分为正常组(5只)、假手术组(5只)、脑外伤组(50只)、死后稳定性组(45只)。其中脑外伤组分为10个亚组，即伤后O、O．5、l、2、4、6、8、12、24、48小时组；死后稳定性组分为9个亚组，即死后6、12小时、l、7重庆医科大学硕士研究生学位论文2、3、4、5、6、7天组；每个亚组均5只大鼠。1．2主要仪器TSJ—Q型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器厂)石蜡切片机(LeicaRM2135

5、型，德国)WZ．ZA微量振荡器(北京海淀电子医疗仪器厂)水浴恒温箱(北京长源实验设备厂)CSl01．2型电热鼓风干燥箱(重庆实验设备厂)病理组织包埋机(BMZ．Ⅲ，国产)牙科钻(佛山市中熙医疗器材有限公司)；BX_4l显微镜图像采集系统(日本Olympus公司)；GD．8型病理影像多媒体操作系统(成都金盘电子科大多媒体技术。)Quantiment570C型图像分析系统(德国Leica公司)1．3主要试剂苏木素(上海化学试剂厂)伊红(上海试剂三厂)无水乙醇(重庆东方试剂厂)二甲苯(上海化学试剂总厂)APES防脱片剂(

6、博士德生物工程有限公司)EDTA溶液(北博士德生物工程有限公司)浓缩型DAB试剂盒(博士德生物工程有限公司)PBS液及抗原修复液(博士德生物工程有限公司)鼠S-ABC即用型免疫组化染色试剂盒(博士德生物工程有限公司)兔抗鼠BDNF单克隆抗体(博士德生物工程有限公司)1．4实验方法1．4．1脑外伤模型的建立参照吴旭，王宝捷‘61等建立大鼠脑损伤模型，实验前12小时大鼠禁食，自由8重庆医科大学硕士研究生学位论文饮水，实验当日用戊巴比妥钠(30mg／kg)腹腔注射麻醉。脑外伤组大鼠麻醉后俯卧位固定于脑立体定向仪上，消毒皮

7、肤，头皮正中切开，切口长2cm，剥离骨膜，暴露前囟和左顶骨，用牙科钻在冠状缝后2mrn，矢状缝左侧2mm处钻一直径5mm圆形骨窗，保持硬膜完整。将撞杆置于硬膜上，用109砝码从20era高处沿外周导管坠落，撞击撞杆从而撞击硬膜，致左顶叶发生脑挫裂伤。打击后切口内滴注4万单位硫酸庆大霉素4．5滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，按实验分组要求分别于伤后即刻(O)、0．5、l、2、4、6、8、12、24、48小时取脑。死后稳定性组大鼠模型建立同脑外伤组，在伤后6h处死大鼠，置于．20"C冰箱，按实验分组要求分别在死后6、12小

8、时、l、2、3、4、5、6、7天取脑。假手术组仅开颅窗后用骨蜡封闭，不施加打击。正常对照组不作任何处理直接处死取材。1．4．2标本处理所有脑组织均用4％多聚甲醛固定24小时后，石蜡包埋，取损伤周围脑组织连续切片，切片厚3lam，分别做HE染色和BDNF免疫组化染色，免疫组织化学染色依照SABC试剂盒说明书操作，PBS代替一抗作阴性对照。1．4．3HE染色1)