家蚕抗浓核病毒(镇江株)相关新基因的筛选及功能研究

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1、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入’有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。伊6年保密囤，在乡年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。．指导教师签名：a6每。f其7日孥■■●h．秀●●名签者，忙日论¨龇月j／＼，。{穸毒独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，

2、本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：V三争场佃日期：矿石年占月f扩日^。；●J√＼●，-，一峄7’●博士学位论文耘基国自鱼篮选壁功li塞硒窒高贵田申请学位级别埴士专业名称壅主晶盘Ⅱ：逖蘧王程论文提交日期2QQ鱼笙§且论文答辩日期2QQ鱼笙目学位授予单位和日期江苤太堂笙目答辩委员会主席评阅人2006年5月◆^●Ph．D．Dissertation“●1^-●ln'ScreeningannIunCtiOnalresearc

3、hSIornovelgenesrelatedtotheresistancetoBombyxmoricIenSOVlrUS-L1●HByGui—TianGaoMajor：AgriculturalBiotechnologySupervisor：Ke—PingChen，professorSheng—LiYang，academicanJiangsuUniversityMay,2006^‘摘要家蚕既是重要的经济昆虫，也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕浓核病毒是蚕业生产上危害比较严重的一类病毒。分离克隆家蚕抗DNV相关基因，研究家蚕与DNV的相互作用关系，对开展抗BmDNV的分子

4、育种、开发DNV杀虫剂以及构建BmDNV家蚕表达载体和开发家蚕的定向插入的转基因载体都具有较大的意义。本研究以家蚕抗浓核病镇江株(BmDNV．Z)品系秋丰D为供体亲本，以感性品系华八35为轮回亲本，成功构建了华八35的近等基因系BC8。并以秋丰D、华八35、BC8三个材料为组合，综合应用荧光差异显示、实时荧光定量PCR、BIO．TEKSYNERGY等现代分子生物学实验技术以及生物信息学、比较基因组学的方法，比较系统研地究了家蚕抗BmDNV-Z的分子机制。1．抗BmDNV-Z的差异表达谱以接种后12h的秋丰D、BC8、华八35的中肠为材料，通过mRNA荧光差异显

5、示，获得3621条带，差异带168条。在抗性品系出现158条特有带，在感性品系中出现10条特有带。在家蚕特定细胞中表达的mRNA应该不过3000．5000种，而本研究构建的近等基因系除抗性基因的差异外，其余99．9％的遗传背景是相同的，即只有0．01％的差异，据此推算，本研究获得的抗BmDNV-Z差异表达谱己覆盖家蚕抗BmDNV-Z相关的所有mRNA。2．家蚕羧酸酯酶基因的全长cDNA在得到的抗性差异条带中，通过5’RACE技术克隆了家蚕羧酸酯酶全长eDNA。其全长为1602bp，编码区长1458bp。编码区与家蚕基因组测序预测的家蚕羧酸酯酶Bmb01462基

6、因的ORF同源性为97％。编码486个氨基酸，用ScanProsite软件分析，发现具有羧酸酯酶的保守结构域：1个丝氨酸活性中心“FGGNPEEVTIAGYSSG”和1个二硫键形成的位点“EDCLI砧WFAP”。因此把该蛋白序列命名为家蚕羧酸酯酶(Bombyxmoricarboxylesterase，BmCarE)。‘该序列已在GenBank上登录(登录号：DQ073457)。3．抗性品系中肠BmCarE活力用BIO．TEKSⅥ呵ERGY法研究感、抗性品系接种后12h、36h、72h中肠BmCarE活力，结果发现抗性品系BC8接种是BCs对照的3．28倍，BC

7、8接种是华八35接种的江苏大学博士学位论文：家蚕抗浓核病毒(镇江株)相关新基因的筛选及功能研究2．26倍，差异达到极显著水平(尸

8、个样品BmCarE酶促反应的米氏常数K