公鸡弱精症相关候选基因的筛选及功能研究

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1、分葦号学号７＾１进互＿＿＾＿Ｉｎｒ密级媛叫大違ＹＡＮＣＩＩｉ／ＨＯＵＩＭＶＩＲＳＩＴＹＪＩ巧壬学化冷文化型）（专公巧弱精症相关候选基因的筛选及功能研究富巧指导教师姓名：陈国宏教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９除继兰研究员，中国农业科学巧，北京，１００１９３申请学位级别：硕壬学科专业名称：农业推广（养巧）论文提交日期：２０１５年５月论文答辩日期：２０１５年５月２２日学位授予单位：巧州大学学位授予日期：２０１５年６月３０日＿＿＿答辩委

2、员会主席：奔锡杰研究员２０１５年５月ＡＳＴＩＰ－ＩＡＳ０４）本硏究由中国农业科学院科技创新工程（；国家自然科学基金：无精症公鸡睾丸发育及蛋白质组研究（３１３７２３０４）资助。ＴｈｅＷｏｒｋｗａｓＳｕｏｒｔｅｄｂＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＰｒｏｅｃｔｏｆｐｐｙｇｙｊｓｅＡｃａｄｅｍｏｆ－ｏｎａｃｅＣｈｉｎｅＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＡＳＴＩＰＩＡＳ０４ＴｈｅＮａｔｉｌＳｉｅｎｃｙｇ（）；Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ；Ｄｅｖ

3、ｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃＳｔｕｄｙｏｆＲｏｏｓｔｅｒＴｅｓｔｅｓｗｉｔｈＡｚｏｏｓｅｒｍｉａ３１３７２３０４．ｐ（）富丽公鸡弱精症相关候选基因的筛选及功能验证Ｉ公鸡弱精症相关候选基因的節选及功能研究中文摘要－。在家禽生产中，据不完全统计，每年有５１２％的种公鸡因产精能力低下遭到淘汰中国的大部分地方鸡品种更是存在繁殖效率低下的显著弱点，其公母配比高于专口化高一一产品种倍レッ上，是产业化程度不高，良种繁育体系不健全的重要原因么。为了探巧

4、公鸡弱精症的发病机理，本课题前期应用数字基因表达谱技术（ＤｉｇｉｔａｌＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＤＧＥ）构建了无精症公鸡与正常公鸡的睾丸差异表达基因数据库。本研究用生物信息学方法重新分析ＤＧＥ数据库，挑选了与公鸡弱精症相关的６个候选基因（Ｃ０Ｚ７及、ＰｒＧＯＳ、片戶饼狀紐４Ｇ６、勝７７、ＣＣＡ趴，从３００只４２周龄的北京油鸡种公鸡的大群体中，进行了为期４周的精液品质检测５－ＰＣ民对迭６，筛出弱精及正常个体各１只。采用ＲＴｑ个候选基因在两姐个体的睾丸姐织中的表达量进行了相对定量检

5、测，来验证ＤＧＥ结果的ｃ－可靠性。从验证的差异表达基因中挑选了ＣＣＡＷ（ｙｃｌｉｎＦ），同时Ｗ鸡精原干细胞ＳＳＣｓ、睾丸支持细胞、ＤＨ细胞为实验模型，进行了Ｈ种细胞ＣＣＡＷ基因表达量的检测用；采ＲＮＡｉ技术，构建的４条慢病毒飽向干扰载体在Ｈ种细胞上做了转染效率和干扰效率的／－检测，筛选出最佳转染效率时病毒滴度ＭＯＩ值和最优干扰序列，应用ＲＴｑＰＣＲ技术检测转染后２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ模式细胞中ＣＣｉＶｆ基因的ｍＲＮＡ水平的表达量：用ＣＣＫ８法检测慢病毒载体ｓ－ｉＲ

6、１侵染后模式细胞在不同时间点细胞周期的变化，为探索公鸡弱精症的发病机理的深入研巧和最终寻找到致病潜在标志物做了基础铺垫。结果表明：－１．ＲＴＰＣＲ对Ｄ畑中挑选的与弱精相关的６个候选基因的定量结果发现，ＣＣ货７及、ｑ尸ｒＧＺＷ在弱精组个体睾丸的表达量显著高于正常个体（戶＜０．０１），ＷＷ２、／ｌＰＧＺ设、ＣＣＡＷ＞＜在弱精组个体的表达量显著低于正常个体（／０．０５），说ＭＧ６在两组睾丸中的表达量没有显著差异，该结果与ＤＧＥ的结果相吻合，说明ＤＧＥ结果可靠，确立了ｃａｒ？公、ｉＴ（巧Ｓ

7、、ＷＡＴ２、ＷＧ公Ｓ、ＣＣＡＷ这５个基因可作为公鸡弱精症的重要候选基因。２．从前期初步验证的候选基因中挑选了ＣＣＡＷ基因，ＳＳＣｓ、睾丸支持细胞、ＤＦ１细胞的定量检测结果显示ＣＣＷＦ在这Ｈ种细胞的表达量相当，说明ＣＣＡＷ基因具有广泛ｎ扬州大学硕±学位论文表达特性。３．在Ｈ种模式细胞上的转染效率检测和干扰载体的筛选结果发现，当病毒液与培养６ｘ＝基Ｗ１：１９即滴度为５ｌ〇ＴＵ／ｍＬ、Ｍ０Ｉ５，此条件下的慢病毒液侵染ＤＦ１和支持细胞ｓ效率可达６０％，而在ＳＳＣ上的转

8、染效率只有２０％，说明慢病毒载体对ＳＳＣｓ侵染效果不佳。进而在ＤＦ１和支持细胞上的ＣＣ７ＶＦ鞭向ｓｉＲＮＡ干扰的定量检测结果显示Ｓ化１转染两种细胞后在７２ｈ和９６ｈＣＣＷＦ基因表达量极显著下调（Ｐ＜０．０１），说明构建的干扰载体能有效沉默这两种细胞中ＣＣ７ＶＦ基因的表达。４．在两种细胞上四个时间点ＣＣＫ８检测细胞活为的结果发现，空白组和阴性对照组ｓｉＲ－细胞活为均没有明显变化，在１干扰的支持细胞中，７２ｈ