结合基因芯片和生物信息学技术筛选弱精症的分子靶标研究

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1、博士学位论文结合基因芯片和生物信息学技术筛选弱精症的分子靶标博士研究生：冯春琼指导教师：郑文岭教授马文丽教授摘要不孕不育是全世界关注的研究课题。目前，不孕不育的发病率有逐年上升的趋势。据报道，每100对已婚夫妇中，就有10对夫妇存在不孕不育问题，其中由男性导致的不育占到了大约一半。在由男性导致的不育中，男性精子活力低是主要的因素之一，临床称之为弱精症。弱精症病因众多，包括感染、精液液化异常、免疫因素、内分泌因素、Kartagener's综合征、染色体异常、精索静脉曲张以及微量元素缺乏和不良生活习惯等因素。临床对弱精症的确诊，需要连续三次取精液，每次间隔3．7天，每

2、次精液常规检查结果都符合WHO弱精症的诊断标准，才可确诊为弱精症。因此患者依从性差、费时、费力，不经济。而且临床还有原因不明的弱精症，称为特发性弱精症，即患者精液常规各项指标均在正常范围，精子数量及运动都属正常，但因精子受精力低而不育。由于弱精症病因众多，要在临床上逐一排查弱精症的致病因素几无可能。正因为如此，弱精症病因不明，发病机制不明确，故无法采取有针对性的治疗措施，治疗方法多为经验式，治疗效果也不令人满意，最终只能选择人工辅助生殖。人工辅助生殖技术的应用，实现了部分不能生育人群的传宗接代的愿望，但同时也对人类社会、伦理和家庭带来了巨大的冲击。因此，深入阐述弱

3、精症致病的分子机制；筛选弱精症特异的分子靶标，为临床弱精症的快速、明确诊断提供理论依据，为后续开展有针对性的治疗，提高治疗效果奠定基础，是具有重大的社会和科学意义的研究课题。摘要对弱精症的分子机制人们已经进行了大量的研究，揭示出了许多与弱精症密切相关的基因或蛋白质。但随着基因组研究的不断深入，类似功能的基因或蛋白质必将会发现得越来越多。显然传统的研究策略，设计一个实验，阐述1至2个基因的功能，效率比较差。而且这种分散的研究，不利于比较各基因间的相互联系和相互作用，不利于弱精症相关基因调控网络的阐明。因此，采用一种高通量的研究方法是大势所趋。基因芯片技术是在一个有限

4、的支持物上，同时固定上成千上万的基因探针，通过一次杂交实验，实现平行、快速、高通量的检测分析，是生命科学研究的利器之一。应用基因芯片技术，研究者进行了大量的基因表达谱研究(oligo表达谱芯片)、基因DNA拷贝数变化的研究(aCGH芯片)，基因突变研究(SNP芯片)等等。高通量基因芯片技术的应用，产生了海量的数据，但数据并不等于信息和知识，因此迫切需要一种新的技术和手段去深入挖掘和阐述隐藏在这些数据背后的生物信息和知识，从而实现资源共享，节约大量的人力、物力和财力。生物信息学技术就是综合运用生物学、信息科学的各种知识和工具，对复杂的生物数据进行获取、处理、存储、分

5、发、分析和解释，从而得到我们能够理解和接受的各种知识。生物信息学技术已经在生命科学、药学等相关领域得到了广泛应用，极大地促进了这些学科的发展。在生物数据爆发式增长的今天，理解大量生物学数据所包括的生物学意义已成为后基因组时代极其重要的课题。生物学数据的巨大积累，辅之以正确有效的工具，将导致重大生物学规律的发现。因此，本课题综合利用基因芯片技术和生物信息学技术，筛选弱精症的分子靶标，有可能在已有的研究结论上，去粗取精，去伪存真，分析真正与弱精症相关的、具有区分性的分子靶标，为下一步深入发现和阐明弱精症的分子机制，为弱精症的确切诊断和有针对性的治疗提供理论基础。选取在

6、南方医院生殖中心因男性弱精症导致不孕不育而就诊的丈夫的精液H博士学位论文样本作为实验组，选取因女性因素导致不孕不育就诊的健康丈夫的精液作为正常对照组，年龄24．48岁。50％Percoll一层法离心后收集精子，加入RNAstore保存液-20。C冰箱保存备用。分别随机选取对照组和实验组精子样本各l2例，每4例合并为一份，用QIAGENRNeasyminikit提取实验组和对照组精予样本的总RNA。1．2％甲醛变性凝胶电泳和Agilent2100BioAnalyzer微流路凝胶电泳检测精子总RNA的质量。之后应用T7Promotorprimer一步法合成cDNA第一

7、链和第二链，aaUTP标记cRNA，纯化后分别用Cy3和Cy5对实验组和对照组样本进行荧光标记。荧光标记样品纯化后测定荧光分子浓度及掺入率，调整浓度后进行cRNA样品片段化反应并与Agilenthumangenome4x44Kmicroarrays杂交。杂交数据上传至GeneSpringGX10工具包中进行差异基因筛选、Pathway分析和GO分析等。进一步，应用BRB．ArrayTools和基于不同算法开发的GSEA基因表达谱数据分析软件分析弱精症芯片杂交数据，BRB．ArrayTools筛选出的差异表达基因与GeneSprin910的分析结果相比较，得到在两种

8、方法中共同