rop9与abi2互作在aba信号通路中的功能分析

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1、分类号学校代码10542密级学号2Q!!Q21垒l逊ROP9与ABl2互作在ABA信号通路中的功能分析ThefunctionanalysisoftheinteractionbetweenROP9andABl2inABAsignalingpathwav1一一一—，指导教师姓名、职称銮盘塾援奎盔屋熬援湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一四年五月＼删删摘要ROP9为拟南芥小GTP蛋白ROPs家族中的第二亚家族中的成员，它作为ABA(脱落酸)反应中的负调节因子，影响着ABA对种子萌发及根生长的抑制作用。而ABl2作为蛋白磷酸酶中的一员，对ABA反应也起着负调

2、控作用。本实验室前期在对ABl2相互作用蛋白的筛库工作中发现ROP9可能与ABl2相互作用。通过分析ROP9与ABl2互作在ABA信号通路中的功能，为揭示ABA信号途径精细的分子机制提供了一定的帮助，对植物抗逆研究具有十分重要的意义。本论文利用酵母双杂交系统对ROP9与ABl2的相互作用进行了进一步的验证，并且通过对ROP9的定点突变，构建了持续激活态的CA．ROP9以及持续失活态的DN．ROP9，将其应用于酵母双杂交系统中。通过对结果的分析发现，正常态的ROP9以及激活态的CA．ROP9能够与ABl2产生相互作用，而失活态的不能与ABl2相互作用。这

3、表明ROP9是以激活的形式与ABl2相互作用的。为了进一步验证ROP9与ABl2在拟南芥细胞内是否也具有相互作用，利用了双分子荧光互补技术对其进行分析，结果证明两者在拟南芥细胞内同样也存在相互作用，并且发现这一相互作用是发生在细胞膜上的。利用农杆菌介导的转基因技术获得了RoPgpm．GUS转基因拟南芥植株。对其进行组织化学染色分析，发现ROP9主要在根尖，柱头，花托以及维管系统中表达，而在气孔中没有发现ROP9的表达。构建ROP9的RNA干扰植株，得到了三个株系。半定量分析结果表明，在这三个株系的RNA干扰植物中，ROP9的表达水平出现了不同程度的下调

4、。表明三个株系的拟南芥植株均为ROP9的RNA干扰植株。对ROP9的T-DNA插入突变体salk111788的植株进行了鉴定，并获得了纯合的突变植株。但通过半定量分析发现其中ROP9的表达水平并未降低，反而与野生型相比有所升高，因此说明其不是有效的ROP9的T-DNA插入突变体。还利用拟南芥转基因技术将ROP9-pEGAD导入植株中，获得了ROP9的过表达转基因植株，并利用半定量分析确定了ROP9过表达植株中ROP9表达水平发生了上调。将ROP9的RNAi转基因植株与过表达植株，种植于含有ABA的MS上，观察其萌发率及生长状态。发现在ABA的处理下，R

5、OP9的RNAi转基因植株的萌发率要明显低于野生型，而过表达植株的萌发率要高于野生型；而未处理下，ROP9RNAi转基因植株与过表达植株的萌发率与野生型没有明显的差别。同时通过原核表达出ROP9、CA．ROP9、DN．ROP9与ABl2蛋白，并进行纯化。将这些蛋白与ABl2一起孵育，然后进行磷酸酶活性的测定，发现正常态的ROP9与激活的CA．ROP9对ABl2的磷酸酶活性具有显著的激活作用。综合上述结果，说明ROP9通过激活ABl2的磷酸酶活性与ABl2相互作用，并在ABA信号途径中起负调控的作用。关键词：ROP9，ABl2，ABA信号途径，磷酸酶活性

6、ABSTRACTROP9isamemberofthetypeIIsubfamilyofROPswhichbelongtosmallGTP—bindingproteins．AsanegativeregulatorofABA(abscisicacid)response，ROP9functionsinABAsignalingbyinhibitingtheseedgerminationandrootgrowth．ABl2isamemberoftheproteinphosphatases，alsoplaysanegativeregulatoryroleinABA

7、response．OurpreviousworkdisplayedthatABl2mayinteractwithtROP9byyeasttwohybridscreening．ThisresearchfocusedonthefunctionalanalysisofproteininteractionbetweenROP9withABl2intheABAsignalingpathway．OurdataprovidecuesindisclosingthefinemolecularmechanismofABAsignalingpathways，andinstr

8、ess—resistantresearchesofplants．Theyeasttwohybr