n-型钙离子通道抑制剂ω-芋螺毒素的表达、纯化及活性研究

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1、分类号学号M201371573学校代码10487密级硕士学位论文N-型钙离子通道抑制剂ω-芋螺毒素的表达、纯化及活性研究学位申请人:张燕学科专业:生物物理学指导教师:丁久平教授答辩日期:2016年5月20日万方数据AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceTheexpression,purificationandactivityresearchofN-typecalciumionchannelinhibitorω-conotoxinCan

2、didate：YanZhangMajor：BiophysicsSupervisor：Pro.DingJiupingHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2016万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：

3、年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在____________年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日万方数据华中科技大学硕士学位论文摘要ω-芋螺毒素（Conopeptide，Conotoxin，CTX）是

4、第一类被确定的特异性阻断电压门控钙离子通道（VGCC）的天然毒素。MⅦA作为一种ω-芋螺毒素，它能够特异性地阻断N-型电压门控的钙离子通道（NGCCs）。NGCCs在控制脊髓神经的疼痛传递中起着极其重要的作用，而MⅦA通过阻断该类离子通道Cav2.2达到镇痛效果，从而具有重要的临床意义。但是目前MⅦA在治疗镇痛时有较大的副作用，包括：眩晕、眼球震颤、嗜睡、步态异常和运动失调等，严重影响了它的广泛应用。最近研究发现，MⅦA突变体ω-2具有与MⅦA同样的镇痛效果但副作用极小，因此大量合成ω-2毒素蛋白能极大推动ω-2应用到更多研究和医药领域。目前为止，绝大多数多

5、肽毒素包括ω-2毒素，主要通过化学方法如固相多肽合成法获得，但是该化学合成法过程复杂、耗时较长且费用昂贵。为此，为了高效经济地获得大量ω-2毒素，本文拟在大肠杆菌表达系统中发展了一种新的ω-2毒素蛋白表达法，并通过此方法获得了具有较高纯度的ω-2毒素蛋白。ω-2毒素蛋白仅含25个氨基酸残基，分子量较小，且ω-2富含二硫键，在大肠[1]杆菌细胞质相对偏还原的环境中纯化表达非常困难。为了得到可溶性的ω-2融合蛋白，我们建立了MBP-ω-2和DsbC在OrigamiB（DE3）细胞质中的共表达体系。在该表达体系中引入DsbC，其目的是促进ω-2中二硫键的正确折叠，

6、从而得到具有生物活性的ω-2毒素蛋白。通过该体系，我们成功获得了可溶性的、空间结构折叠良好且纯度较高的ω-2毒素蛋白。最后通过电生理实验，检测到ω-2对外源表达的Cav2.2有一定的阻断效果，从而确定其生理作用。综上所述，本人硕士期间成功建立了在大肠杆菌表达体系中获得ω-芋螺毒素MⅦA突变体ω-2毒素蛋白的有效方法，该方法为高效经济地大量合成ω-2提供了保障，具有一定的经济和临床应用前景。同时，该项工作为其他类似多肽毒素的生物批量合成提供了借鉴，有效推动了生物多肽毒素在药物应用领域的研究。关键词：芋螺毒素；ω-2；NGCCs；Cav2.2；I万方数据华中科技

7、大学硕士学位论文Abstractω-conesnailtoxin(Conopeptide,Conotoxin,CTX)isthefirstkindofnaturaltoxin,whichisidentifiedtospecificallyblockvoltage-gatedcalciumchannels(VGCC).MⅦAasakindofω-conotoxin,itcaninteractN-typevoltage-gatedcalciumionchannels(NGCCs)specifically.NGCCsplayanimportantroleinthe

8、transmissionofpaininthespi