芋螺毒素基因mai126在大肠杆菌中的高效表达

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1、摘要芋螺属(CD咒“s)大约包含500多种不同的肉食性芋螺(Conesnail)。按照芋螺的食性，可以将其分为三类；食虫类(Ve册ivorous)，食螺类(Molluscivorous)和食鱼类(Piscjvorous)。每种芋螺的毒液中都包含50一200种不同的毒素多肽。这些小肽富含半胱氨酸(Cvs)，分子量小(10一40氨基酸)，而且氨基酸序列中存在很多翻译后修饰。芋螺毒素肽主要包括两大类：富含二硫键的c衄otoxin(凹X)和不含二硫键的小肽。按照芋螺毒素的信号序列和Cys模式，可以将其分为若干超家族：O．，M．，A．，S．，T．，P．，1．。按照芋螺毒素的药

2、理学活性，可将这些超家族进一步分类。如：A．超家族(a．、aA．、lCA．和p．conotoxins)；M．超家族(．￡1．、、l，．conotoxills)；O．超家族(∞一、∥O，、d．和K-conotoxjns)；T．超家族(t．和廿conot0XjJls)等等。每种芋螺毒素都有其特异性作用的受体亚基或离子通道。目前，多种芋螺毒素的靶点得到了鉴定，包括：电压门离子通道亚基、配体门离子通道亚基和G蛋白偶联受体等。因此，由于芋螺毒素有望成为神经科学研究的新型工具和治疗疾病的新型药物，而引起了人们的广泛注意。本实验室从海南产大理石芋螺(C伽凇小口册D肥凇)中克隆到了

3、一个新的■超家族芋螺毒素Mall26基因。本研究采用基因工程技术在大肠杆菌中表达该基因。通过构建Mall26(42bp)的片段串联体(片段通过一个Met进行连接)，然后将串联片段与表达载体pET-31b(+)进行连接，构建重组体。目的基因位于KSI基因的下游和HisTag基因的上游，在大肠杆菌(EcD豇)中高效表达了KSI．(Mall26)n．His6融合蛋白，并通过Ni亲和层析对表达蛋白进行纯化。纯化后的蛋白可进行CNBr切割，释放不溶性的KSI和His尾部，得到单个Man26肽段。通过反相疏水层析(RP．HPLC)可对表达的conotoxinMall26进行纯化

4、，为进一步研究和利用该芋螺毒素药物先导化合物提供了基础。关键词：T-超家族芋螺毒素Mall26，大肠杆菌高效表达，重组多肽分离和纯化AbstractThegenuscD终“scontainsabout500differentspeciesofpredatoryconesnails．ConesnailsaregenerallydiVidedintothreegroupsaccordingtotheirprey：Ve咖iVorous(wom-hunting)species，mollusciVorous(snail-huntin酚andpisciVorous(fish_h

5、untin曲conesnajls．EachofthemContains50to200dif．ferentpeptidesintheVenomnamedconotoxin，conopeptideorCTX．ConopeptidesafealsodistinctiVebyVirtue0ftheirrichCys，smallsize(10一40aa)andhighdegreepost-translationalmodifjcatjon．Conopeptidesf-allintotwomaincategories：djsulfide·rjchcOnotoxjnsandpep

6、tidesthatlackmultipledjsulfides．IIlte姗softhesi印alsequenccsaIldpattemdisulfide1inkages，conotoxinscanbediVidedintosOmesuperfamily：O一，M-，A，，S-，’r-，P·，I·．Thesupef‰ilymaybesubdiVidedintoseVeralfamilieswithdistinctpha咖acologicalactiVities，forexampleA—superl’amily(a一，aA一，’：A-andp-conotoxins)；

7、M-supe砌mily“-aIld、I，一conotoxins)；O-superfamily佃·，∥o，d-，锄d1c-conotoxins)；T-superfamily(t—aIld好conotoxins)andsoon．111diVidualconotoxinisselectiVelytargetedtoaspecificisofo珊ofreceptororionchannel．AVarietyofsuchtargetshavebeenidentified，includingmanyVoltage-gatedandligand-gatedionchannel