Alpha-芋螺毒素TxID合成方法的优化.pdf

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1、第5卷第2期热带生物学报V01．5No．22014年6月JoURNAL0FTRoPICALBIoLoGYJun．2014文章编号：1674—7054(2014)02—0107—04Alpha一芋螺毒素TxlD合成方法的优化吴勇，朱芙蓉，刘倩，长孙东亭，罗素兰(海南大学热带生物资源教育部重点实验室／海I3市海洋药物重点实验室，海南海13570228)摘要：在常规两步氧化法合成的基础上，对芋螺毒素TxlD第2对二硫键形成的条件进行了优化。优化条件包括有无氮气保护、氧化试剂中碘的浓度、三氟乙酸(TFA)含量

2、、氧化时间等多个参数，研究其对TxlD氧化折叠的影响。结果表明，氮气保护有利于TxlD的氧化折叠，碘浓度需5—10倍于巯基浓度，TFA含量对氧化折叠影响不明显，氧化时间约5min为宜。关键词：一芋螺毒素TxID；化学合成；碘氧化；优化；二硫键形成中图分类号：Q179．4文献标志码：A芋螺毒素(Conotoxin，CTx)是热带海洋中的肉食性软体动物——芋螺，分泌产生的一类用于捕食和防御的神经毒素肽，其多样性高、活性强、能区分各种离子通道和受体的不同亚型。芋螺毒素已成为当今国际生物药物研究的热点，其中的

3、Alpha(O／)家族芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC—C——C，且相对分子量小，在芋螺体内广泛分布，是乙酰胆碱受体(nAChRs)各种亚型的选择性阻断剂的重要来源。芋螺毒素具有巨大的潜在药用价值¨I2J，已有多种芋螺毒素进入临床研究。O／一芋螺毒素(—cTx)TxID是本实验室从海南产织锦芋螺(Conustextile)中发现的，其序列结构如图1A所示，含有2对二硫键，属于／6型亚家族，是迄今发现的a3乙酰胆碱受体活性最强的特异阻断剂，其半阻断剂量(IC∞)仅为12．5nmol，具有重要的研究和开发价值

4、。至今仅发现2个3nAChR亚型一的特异阻断剂，即本研究的O／．CTxTxlD和以前发现的一cTxGc。SHPV9SAMSP’AuIB。O／．CTxTxID对3nAChR的阻断活性要比AulB的活性强60倍，是很难得的分子探针和先导药物。由于TxlD序D列中含有易氧化的甲硫氨酸(Met)，在化学合成过程中易被氧化形成甲硫氨酸亚砜(图1B)，增加了合成难度，阻碍了对此芋螺毒素的进一步深入研究和开发。特别是在采用常规的两步氧化H法形成第2对二硫键时，碘氧化过程中甲硫氨酸极易被氧化。本研究通过优化TxlD合

5、成过程中二硫键形成条件，以防止甲硫嘲Ot一芋螺毒素TxlD序列及二硫键连氨酸被氧化，提高．CTxTxlD的合成效率，旨在获得足量的活性接示意图(A)以及甲硫氨酸氧化结肽用于后续研究与开发。构示意图(B)1材料与方法盹．三二一1．1材料三氟乙酸(色谱级)购于阿拉丁试剂公司；乙腈(色conotoxinTxID；B·DiagramofMe’谱级)购于赛默飞世尔(中国)科技公司；甲酸、乙醚等均为国产thi。nine。xidati。n分析纯。全自动多肽合成系统ABI433，Waters2695高效液相色amid

6、砒edc00He丌ni“收稿日期：2014—04—02基金项目：国家国际科技合作专项(2011DFR31210)；国家自然科学基金(41366002)；长江学者和创新团队发展计划(IRT1123)；海南省自然科学基金(313047)；海南省社会发展科技专项(SF201328)；海13市重点科技计划项目(2013—16)作者简介：吴勇(1982一)，男，助理研究员，研究方向：海洋药物．E-mail：wys211@163．com通信作者：罗素兰，女，教授．研究方向：海洋药物．E-mail：luosulan

7、2003@163．eom热带生物学报谱仪，Waters2535半制备色谱仪，VydacC18分析柱、制备柱(购于上海申越公司)；岛津ESI—MS；High—flowC18小柱购于Alhech公司。1．2方法1．2．10c．CTxTxID线性肽的合成一芋螺毒素TxID树脂肽采用Fmoc方法合成。树脂为Amide-AM树脂，从多肽的C端至N端进行合成，HBTU／HOBt／DIEA活化法合成多肽。树脂肽用试剂K在室温下切割2h，过滤后，用10～20倍体积的一20℃冰乙醚沉淀、离心洗涤3次，获得线性肽沉淀，并

8、溶解于B60(=0．1％1’FA，=60％乙腈水溶液)中，使用VydacC18制备柱纯化，条件为：线性梯度洗脱40min，起始条件：=90％BufferA(=0．1％TFA水溶液)，=10％BufferB(=0．075％TFA，=90％乙腈水溶液)；终止条件：=40％BufferA，=60％BufferB，流速为15mL·min～。紫外吸收值为214nm，纯化后质谱鉴定，冻干保存。1．2．2．CTxTxID第1对二硫键的形成多肽前体溶解乙腈水溶液中，进一