海南产芋螺毒管cdna文库毒素基因的筛选

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1、中文摘要芋螺(Conus)属于软体动物门(Mollusa)腹足纲(Gastropoda)前鳃亚纲(Prosobranchia)狭舌目(Stenoglossa)的芋螺(Conidae)科，是一类能分泌有毒毒素的肉食性热带海洋软体动物，其分泌的毒素称为芋螺毒素(Conotoxin，CTX)。芋螺毒素由10"--46个氨基酸残基组成的小分子多肽，富含二硫键。由于芋螺毒素的化学结构新颖，生物活性强，作用靶点的选择性高，引起了全世界相关领域科学家们的普遍重视，现已广泛应用于研制特异性诊断试剂以及开发疗效特异的新药之中，并作

2、为分子模型用于相关新药的设计。构建基因文库是分离克隆新基因和获得大量基因序列信息的有效途径，而cDNA文库技术在基因分离和克隆中具有重要的作用，并得到广泛应用，这也是进行功能基因组研究的⋯条经济而快速的途径，极大推进了功能基因组的研究。由于芋螺资源的短缺、以及天然芋螺毒素含量甚微，借助这一现代基因工程技术分离克隆芋螺毒素基因，再根据这些基因的序列推导其编码产生的芋螺毒素氨基酸序列，然后对其进行化学合成或重组表达，进一步研究其生物活性，是研发芋螺毒素药物的必要途径。我导师课题组采用SMART方法构建了海南产的桶形芋

3、螺、勇士芋螺、疣缟芋螺和织锦芋螺毒管的cDNA文库。本研究在此基础上，采用3’RACE方法，对上述4种芋螺毒管的cDNA文库进行毒素基因的筛选。分别以cDNA文库葭液及其质粒为模板，根据己知超家族芋螺毒素基因保守的信号肽序列，设计各个家族的5’．端上游特异引物，分别与3’．末端的接头引物配对，进行PCR扩增，将扩增获得的特异DNA条带回收纯化后，连接到pGEM．Teasy载体上，再转化大肠杆菌XLl，经酶切和序列测定分析，推导其编码产生的毒素肽氨基酸序列，并与已知的毒素基因进行对比，结果表明在各文库中均筛选出了多

4、个芋螺毒素新基因，可为进一步发掘和利用这些新芋螺毒素奠定研究基础；经实验证明，3'RACE法扩增筛选文库，是一种快速、有效的功能基因筛选法，可以作为相关cDNA文库快速高效筛选的模型。关键词：芋螺；毒管cDNA文库；Y-RACE；文库筛选；芋螺毒素基因克隆AbstractConusisonegroupofthetropicalcarnivorousmarinemolluscsbelongingtothemolluskgategastropodaprosobranchiastenoglossabranchconid

5、aefamily．Thevenomfromconesnailscontainsadiversemixtureofpharmacologicalagents，mostlysmall，disulfide—richstructurallyconstrainedpeptides(conotoxins，conopeptidesCTX)．Generally,conotoxinsconsistof10—46aminoacidresiduesandalthoughsmallinsize．Theirnovelstructure，s

6、trongbioactivitiesandunprecedentedselectivityintargetingspecificmolecularformsofionchannelshavebeenresultinginanimportantfocusofpresentmarinemedicineresearchintheworld．Now,conotoxinsarewidelyusedinneurophysiologyasstandardagentsinmedicaldiagnosisandinpreparin

7、gnoveldrugswithspecifictherapeuticefficacy．Conotoxinsarealsousedindrugdesignasmolecularmodels．Constructinggenelibrarycanobtainmanygenesandgetcompletegeneinformation．eDNAlibrarieshaveplayedanimportantroleinfunctiongenecloning，whichhasbeenappliedwidelyinfunctio

8、nalgenomicresearch．Itisalsoaneconomical、rapidandeffectivewaytodiscovernewfunctionalgenes．AsConusresourceisabsentandtheamountofnativeconotoxinisverylittle，wemakeuseofthemodemgeneengineerin