新A超家族芋螺毒素Bt14.10的克隆及合成研究.pdf

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1、598军事医学2014年8月第38卷第8期MilMedSei，Vol38，No8，Aug，2014新A超家族芋螺毒素Btl4．10的克隆及合成研究王菲，张龙霄，李靓，刘珠果，戴秋云[摘要]目的从我国南海西沙附近海域的桶形芋螺(Conusbetulinus)中克隆出新型A一超家族芋螺毒素Btl4．10，并利用化学方法合成该毒素，鉴定其二硫键连接方式。方法提取桶形芋螺毒腺管基因组DNA，基于非翻译区及内含子序列设计合成引物进行PCR，获得Btl4．10的序列。采用Fmoc一固相法合成线性肽Btl4．10，通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物，利用两步折叠法测定其二硫键连接

2、方式。结果发现一种新的A超家族芋螺毒素DNA序列Btl4．10，其编码的成熟肽序列为CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2，二硫键连接方式为“C1一C3，c2一c4”。结论BT14．10是一种新型A超家族芋螺毒素，具有A超家族芋螺毒素较为少见的ⅪV型半胱氨酸骨架结构。[关键词]A超家族芋螺毒素；克隆；内含子；合成；二硫键[中图分类号]R996．3[文献标志码]A[文章编号]1674-9960(2014)08-0598-04DOI：10．7644／j．issn．1674—9960．2014．08．008CloningandsynthesisofanewA-superf

3、amilyconotoxinBtl4．10WANGFei，ZHANGLong—xiao，LILiang，LIUZhu—guo，DAIQiu—yun(1．InstituteofBiotechnology，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China；2．CollegeofLifeSciences，AnhuiUniversity，Hefei236041，China)Correspondingauthor。E—mail：qY—dai@yahoo．com[Abstract]ObjectiveTocloneanewcon

4、otoxinBt14．10fromCoal1．sbetulinusderivedfromtheSouthChinaSea，synthesizethepeptide，andtodeterminelinkageofitsdisulfidebridges．MethodsThegenomicDNAwasextractedfromC．betulinusvenomductwhiletheBtl4．10sequencewasclonedusingprimersdesignedbasedontheuntranslatedregionandintron．Thepeptidewasthen

5、synthesizedusingsolid—phasemethodandfoldedintothetargetproductwhosedisulfidebridgeconnectionwasfurtherdeterminedbytwo—stepoxidativefolding．ResultsAnovelconotoxindesignatedasBt14．10(CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2)wasobtained，thedisulfideconnectivityofwhichwas”C1·C3，C2一C4”．ConclusionBt14．10isanewA—

6、superfamilyconotoxinandhasadistinctloopspacingpattembetweencysteinesinA—superfamilyconotoxins．[Keywords]A—superfamilyconotoxin；cloning；intron；synthesis；disulfide—bridges芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类具有神经药族_4J，根据半胱氨酸骨架，结合其药理学作用靶理学活性的多肽，它来源于海洋生物芋螺，一般由点，又将其分为仅、(1)、K、8、、盯、P、加压素、惊10—46个氨基酸残基、多对二硫键组成j

7、。芋螺毒厥剂和睡眠肽等若干个亚家族J。据文献统计，在素可作用于各种离子通道(如Na、K、Ca。通道2007—2011年新发现的芋螺毒素中，含4个半胱氨等)和神经递质受体[烟碱型乙酰胆碱受体酸芋螺毒素比例约占50％，分属于A，M，O1，02，(nAchR)及N．甲基谷氨酸受体(NMDAR)]等。其T，J，L，I2，B3等家族，主要作用于乙酰胆碱具有相对分子质量小、结构稳定、活性强、靶点特异受体，一些作用于Na、K、ca等离子通道，但大部性高及易于合成等优点，已成为药理学的优良探分作用靶点未知。含4个Cys的芋螺毒素的半胱针_2J，并在开发治