glur2-nr1a嵌合体来研究n-甲基-d-天冬氨酸（nmda）受体n末端对受体装配的影响

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1、浙江大学硕士学位论文GluR2-NR1a嵌合体来研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体N末端对受体装配的影响姓名：单凌申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：罗建红20070501浙江大学碗士学位论文英中文对照及缩略写英文中文缩略写NterminaldomainN末端结构域NTBimolecularfluorescence双分子荧光互补法BiFCcomplementationFluorescenceResonanceEnergy荧光共振能量转移法F】f礓呵Transferendoplasmicreticullum内质网ERmetabotropicglutamaterec

2、eptorligand代谢性谷氨酸受体配mGluRl．LBDbmdmgdomain体结合结构域a-aminocyclopentane-1，3-dicarbaxylatea．氨基一3一羧基一5AMPA一甲基嗯唑一4一丙酸N—methyl—D-aspartateN一甲基一D一门冬氨酸NMDAKainateAcid红藻氨酸KAaminoterminaldomain氨基末端结构域舯ligandbindingdomam配体结合的结构域LBDpcriplasmicbindingpmtcms质周结合蛋白PBPprotein—fragmentcomOementafion蛋白片段互补测定法PCA

3、assaygreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白GFP2浙江大学硕士学位论文GluR2-NRla嵌合体来研究N一甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体N末端对受体装配的影响浙江大学医学院神经生物学硕士研究生单凌导师罗建红教授中文摘要兴奋性突触突触后亲离子型谷氨酸受体主要是AIIPA(a-amino-3-hydroxy一5一methyl一4-isoxazolepropionate，AMPA)受体和NMDA(N—methyl—D-aspartate，NMDA)受体，二者协同完成兴奋性突触的传递和介导复杂的生理功能。已知NMDA受体与许多复杂的生理和病理机制有关，如突

4、触的可塑性、长时程增强作用(LTP)、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。已克隆到7个编码NMDA受体亚单位蛋白的基因，即NRI、NR2A-2D和NR3A，3B。其中NRl为一个独立的基因，但可产生8个剪接变体；NR2现共有4个相关的基因，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D；NR3现则有2个基因，分别为NR3A和NR3B。重组受体的研究表明：NRI亚单位是NMDA受体复合物的必需组分，而不同的NR2亚单位则可与NRl形成具有不同通道特征的NM])A受体复合物。NMI)^受体普遍认为是由NRl和NR2亚单位组成的异四聚体。目前关于NMI)A受体的功能性研究已经非

5、常深入，但是，NMDA受体装配的选择性调控机制还不是很清楚。而且还没有找到特定NMDA受体各亚基上控制形成同聚或者异聚体的区域。先前有研究报道，NMDA亚单位的N末端对于受体的装配有主要作用。该实验是建立在免疫共沉淀的方法之上，尽管实验技术比较成熟，但是，由于要经过细胞裂解搜集等步骤常常不能反映生理情况，或者不能用于活细胞的观测。近年来一种新的荧光技术一一荧光共振能量转移(FRET)被广泛地应用到受体装配的研究，该方法可以检测距离在10眦之内的蛋白之间的相互作用，而受体亚单位复合物之间的距离已被普遍认为在此范围之内，而且该技术可以实现活细胞内的实时观测，我们实验室利用此方法，通

6、过N端不同区域截短的实验发现，N3浙江大学硕士学位论文端在NWl)A受体亚单位同聚体和异聚体装配中并不起到决定性的作用。为了更进一步的研究NMDA受体N末端对受体装配的作用，我们首先选择了NRI亚单位，因为不同的NRl剪接变体也赋予NIHDA受体通道不同的功能特征，而且NRl广泛表达于各个脑区，是NMD^受体通道的必要组成成分，有一定的代表性。然后构建了NRl与GluR2的N末端不同区域(ATD，S1，以及NT)的嵌合体，包括：XFP．NRl-ATD．GluR2，XFP-NRI．S1．GIuR2，XFP-NRl．NT-GIuR2。经酶切和测序鉴定确定构建物的正确性，进一步转染H

7、EK293细胞证实这些CFP和YFP标记的受体亚单位具有良好的荧光信号。以这些表达载体为工具，结合活细胞表面受体免疫染色技术和荧光能量转移技术，我们进一步观察了这些嵌合体之间，或者与野生型NRI，NR2亚单位的装配，膜表面表达情况，获得了如下研究结果：(1)为了研究NRla亚单位N末端是否存在协同NR2B亚单位到达膜表面的功能区，将XFP．NRl-ATD-GluR2，XFP．NRl．S1．GluR2XFP-NRl．肌GIuR2，分别与NIi2B共转染到HEK293细胞中去，然后采用抗GFP抗