敲低txnip对高糖诱导小鼠系膜细胞凋亡的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文敲低TXNIP对高糖诱导小鼠系膜细胞凋亡的影响姓名：赵坡申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：史永红201203中文摘要敲低TXNIP对高糖诱导小鼠系膜细胞凋亡的影响摘要目的：糖尿病肾病(ON)是最常见的糖尿病微血管并发症，一旦肾脏发生损害往往造成不可逆进展。在需要透析的临床病人中，DN患者大约占20％'-'40％。所以如果能够实现DN的早期诊断与治疗，对于提高患者的生活质量及改善预后有着重要的临床意义。目前对于DN的发病机制尚不清楚，通过大量的研究证实氧化应激在DN的发病机制中发挥了非常重要的作用。硫氧还蛋白(thioredox

2、in，ⅡⅨ)是一种具有氧化还原活性的小分子蛋白，TRX与TRX还原酶及还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)一起组成一个分布广泛的NADPH依赖性二硫化物还原酶．TRX系统。具有调节细胞氧化还原状态、对抗氧化应激、激活转录因子、促进细胞生长以及抑制细胞凋亡等作用。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteractingprotein，TXNIP)又称维生素D3上调蛋白1(VDUP．1)或TRX结合蛋白2(TBP．2)，属于硫氧还蛋白结合蛋白的家族成员，通过抑制硫氧还蛋白系统的功能而发挥介导氧化应激、抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡等作用，是TRX的负性调节因子

3、。以往的研究证明TXNIP参与高糖诱导的胰岛p细胞凋亡及糖尿病相关性心肌细胞凋亡。然而，TXNIP在高糖诱导下小鼠系膜细胞凋亡中的作用还未见报道。在本实验中，我们应用体外培养的小鼠系膜细胞，采用TXNIP小干扰RNA敲低TXNIP表达，观察其对高糖诱导的系膜细胞凋亡、cleavedcaspase．3表达以及Bax／Bcl一2比率的影响。方法：构建针对TXNIP的siRNA干扰质粒pBAsim—U6．Neo．TXNIPsiRNA，使用Lipofectamine2000转染试剂将TXNIPsiRNA质粒和对照质粒分别转染MMCs，经G418筛选稳定的MMCs细胞系。以正常

4、糖浓度(NG)和NG加甘露醇培养的MMCs为对照，以HG刺激MMCs，采用抗氧化剂(Temp01)处理MMCs。流式细胞仪检测细胞内的ROS水平，TUNEL法检测凋亡细胞数目，RT-PCR检测细胞Bax和Bcl．2的mRNA的表达。蛋白印迹法检测细胞内cleavedcaspase．3、caspase．3、Bax、Bcl．2、13-actin和TXNIP的表达。中文摘要结果：l高糖对MMC的凋亡的影响。与正常糖浓度及对照组相比，高糖能够明显诱导系膜细胞凋亡。与正常糖浓度及对照组相比，高糖组Bax／Bcl．2mRNA和蛋白比率明显升高。另外，甘露醇对细胞凋亡、Bax／Bc

5、l．2mRNA和蛋白比率无明显影响。2高糖对系膜细胞cleavedcaspase．3表达的影响。Cleavedcaspase．3在高糖条件下培养的小鼠系膜细胞表达呈时间依赖性。在高糖作用12小时cleavedcaspase．3表达开始升高，48小时维持高水平。3敲低TXNIP表达对高糖诱导的MMC凋亡的影响。与高糖组和载体对照组相比，TXNIPsiRNA转染组TXNIP蛋白水平明显降低，证实TXNIPsiRNA对系膜细胞TXNIP抑制效果明显。与高糖组和载体对照组相比，TXNIPsiRNA转染组细胞凋亡数显著减少。抗氧化剂tempol也能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡。

6、同样，转染TXNIPsiRNA质粒或tempol均能够下调高糖条件下Bax／Bcl．2mRNA和蛋白的比率。4敲低TXNIP表达对高糖诱导cleavedcaspase．3表达的影响。与NG组相比，HG组cleavedcaspase．3的表达明显升高。转染TXNIPsiRNA质粒或tempol处理后，高糖诱导的cleavedcaspase．3高表达明显被抑制。5敲低TXNIP表达对高糖诱导ROS产生的影响。与NG组相比，HG组ROS水平明显提高。甘露醇对照组与NG组相比ROS表达无明显变化。转染TXNIPsiRNA质粒或tempol处理能够明显下调高糖诱导的ROS产生。

7、结论：1TXNIP参与了HG诱导的MMC细胞凋亡。2敲低TXNIP表达能够减少HG诱导的细胞凋亡及cleavedcaspase．3、Bax／Bcl．2的表达。3敲低TXNIP抑制HG诱导的MMC细胞凋亡可能是通过减少氧化应激反应实现的。胞关键词：高糖；硫氧还蛋白相互作用蛋白；细胞凋亡；肾小球系膜细英文摘要TheeffectsofTXNIPknockdownonhighglucose—inducedaDODt0SlSlnm0USemeSanRlalcells●_-_ABSTRACTObjectives：Diabeticnephropathy(DN)is