ss-31对高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞调亡的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文SS--31对高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞调亡的影响姓名：王月华申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：史永红201203中文摘要SS-31对高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响摘要目的：糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是全球终末期肾脏疾病的首要原因。实验性DN证实，肾小球固有细胞缺失和系膜细胞凋亡与蛋白尿恶化有关。先前的研究表明，高糖(highglucose，HG)诱导系膜细胞凋亡引起系膜细胞缺失是导致糖尿病肾损伤的主要机制。高糖通过

2、产生糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)、激活蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、增加转化生长因子．p(transforminggrowthNcmr．D，TGF．D)、GTP结合蛋白和细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)表达等途径介导细胞凋亡。ROS是各种途径的共同特征，也是高血糖损伤机制的核心。正常情况下，ROS受内源性抗氧化剂系统控制，包括维生素C、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶等。

3、当ROS与抗氧化剂之间的平衡被打破时即发生氧化应激。过多的ROS通过氧化膜磷脂、蛋白和核酸触发凋亡通路并最终引起细胞死亡。我们最近的研究表明，抗氧化剂Tempol或敲低TXNIP能够抑制HG诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡、ROS产生和p38MAPK及ASKl活化。以上研究结果表明，高糖通过氧化剂依赖机制诱导肾小球系膜细胞凋亡。ROS产生的主要部位是线粒体，在糖尿病血管并发症中起着重要作用。SS一31肽(D．Arg一2’，6'-dimethyltyrosine．Lys．Phe．NH2)属于小分子可渗

4、透细胞的肽家族，靶向聚集在ROS产生的部位——线粒体内膜。SS一3l能够清除细胞内ROS和减少线粒体ROS产生，从而防止线粒体通透性改变(mitochondrialpermeabilitytransition，MPT)和细胞色素C释放。以往的研究表明，SS．3l能够抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾小管损伤。高糖处理人视网膜上皮细胞的研究发现，SS．31能减少细胞凋亡和线粒体ROS产生、稳定线粒体膜电位(△、壬，m)、减少细胞色素C由线粒体向胞浆释放和caspase．3表达。然而，SS

5、．31在HG诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用是未知的。我们推测，SS．31能够通过减少线粒体ROS产生和防止线粒体氧化中文摘要损伤，从而抑制高糖诱导的细胞凋亡。在本研究中，我们应用体外培养的小鼠肾小球系膜细胞(mousemesangialcells．MMCs)观察了SS．31对HG诱导的ROS产生、细胞凋亡、线粒体功能障碍和p38MAPK及ASKl活化的影响。方法：小鼠系膜细胞(MMCs，ATCCno．CRL．1927)来自美国菌种保藏中一I',,(Manassas，VA)。细胞培养于含有1

6、0％胎牛血清，2mML一谷氨酰胺，100IU／ml青霉素和100I-tg／ml链霉素的DMEM．F12培养基中，置于5％C02，37。C培养箱中常规培养。待MMCs达75％～85％融合后，用无血清培养基同步细胞24h。细胞分组如下：正常糖组NG(5．6mM)，NG+甘露醇组(24．4mM)作为渗透对照，高糖组HG(30mM)，HG+SS．31组(100nM)。于刺激48h后收集细胞及上清液，进行以下检测：采用原位末端转移酶标记技术(terminaldeoxynucleotidyltransfer

7、ase．mediateddUTP．biotinnickendlabelingassay，TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡率；流式细胞术检测线粒体膜电位及线粒体ROS产生；Westemblot检测caspase-3、Cleavedcaspase一3、Bax、Bcl一2、p38MAPK、p-p38MAPK、ASKl、P．ASKl、TXNIP、TRX．2及细胞色素C的表达；real．timePCR检测TXNIP、TRX．2mRNA的表达。结果：1．SS．31对高糖诱导小鼠系膜细胞凋亡的影响TUNE

8、L和流式细胞术检测结果表明，与正常糖对照组(NG)相比，高糖组凋亡细胞数显著增加；与高糖组相比，SS．31干预能够显著减少高糖诱导的细胞凋亡。与NG组相比，高糖组Cleavedcaspase．3表达和Bax／Bcl．2比率显著增加；SS．31干预能够显著抑制HG诱导的Cleavedcaspase．3表达和Bax／Bcl一2比率。甘露醇对细胞凋亡，Cleavedcaspase．3表达和Bax／Bcl．2比率无影响。2．SS一31对HG诱导的系膜细胞线粒体细胞色素C释放的影响与NG组相比，高糖组胞浆