ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响

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1、Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的影响【关键词】Ghrelin；高血糖；心肌细胞；凋亡caspase3　　心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改变之一，长期心肌细胞凋亡的发生，将会导致临床早期心肌舒张功能障碍、晚期合并心肌收缩功能障碍及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究发现，Ghrelin可以抑制多种细胞的凋亡，如成骨细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、内皮细胞及神经元等，但Ghrelin对高糖环境下心肌细胞凋亡影响的相关文献报道较少。因此，本实验以高糖环境培养心肌细胞，Ghrelin作为干预因素，旨在探讨Ghrelin对高糖诱导心肌细胞凋亡的

2、影响，从而为糖尿病心肌病的防治提供新思路。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞　　新生1～3d的SD大鼠的心肌细胞（重庆医科大学动物实验中心提供）。　　1.1.2主要试剂　　Ghrelin(美国PhoenixBiotech公司)，DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅱ型胶原酶及胰酶（均购于Sigma公司），PBS、αactin单克隆抗体、SABC试剂盒、TUNEL检测试剂盒及DAB显色试剂盒（均购于武汉博士德生物技术公司），caspase3活性检测试剂盒（购于南京凯基生物公司）。　　1.2实

3、验方法　　1.2.1原代心肌细胞的分离与培养　　取出生1～3d龄SD大鼠10～15只，无菌条件下取心脏，仔细剥离心包膜去除心房及大血管，剩余组织于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶侧壁上，用眼科剪将心组织剪成约1mm3碎块。加入5倍体积的0.08％胰蛋白酶，反复吹打后36℃水浴消化7min，静置，待自然沉降后弃上清。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08％胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8min，静置后将上清液移入10ml离心管中，反复吹打至无细胞团块后用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。剩余沉淀用同样条件

4、及方法继续消化，一般经8～10次消化即可将组织消化完毕。各次消化产物以1000r／min离心8min，弃去上清液后将细胞重悬于含15％胎牛血清的DMEM培养液，然后接种于50ml培养瓶，37℃，5％CO2培养箱中孵育1.5h去除贴壁的成纤维细胞。轻轻吸出上层细胞悬液，调整接种密度，将细胞接种于24孔板（板底铺盖玻片），置37℃，5％CO2培养箱中培养(培养液中加入5溴脱氧尿嘧啶0.1mmol/L,以抑制成纤维细胞增殖)，培养48h换液，以后每2d换液1次。　　1.2.2台盼蓝拒染实验检测原代心肌细胞存活率　　将0.4％台盼蓝溶液与细胞

5、悬液等比例混匀，滴入细胞计数板，2min后于倒置相差显微镜下计数，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算细胞存活率〔%，活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%〕，重复3次。　　1.2.3心肌细胞纯度鉴定　　细胞培养第3天取出细胞爬片，4％多聚甲醛固定30min后，用0.01mol／LPBS漂洗3次。加入3％H2O2消除过氧化氢酶，封闭血清，室温封闭30min后加入以１∶300稀释的兔抗大鼠特异性αactin抗体于4℃孵育过夜。然后分别用荧光标记的山羊抗兔ＩｇＧ抗体37℃避光孵育60min。PBS清洗3次后立刻荧光显微镜下观察，绿

6、色荧光染色的细胞即为阳性心肌细胞。阳性细胞百分率(%)＝阳性细胞数/细胞总数×100%，重复3次。　　1.2.4实验分组　　原代心肌细胞培养3ｄ后进行实验分组，分为以下3组：①正常对照组（N组)：葡萄糖浓度为5.5mmol／L;②高糖组（Ｈ组）：葡萄糖浓度为25.0mmol/L；③高糖+Ghrelin组（G组）：酰基化Ghrelin终浓度为107mol/L，葡萄糖浓度为25.0mmol/L。　　1.2.5TUNEL法检测心肌细胞凋亡　　将各组细胞爬片用PBS洗3次后，4％多聚甲醛固定30min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，同时设

7、置阳性与阴性对照。检测结果判断：光镜下阳性细胞为细胞核中有深浅不一的棕黄色颗粒（DAB显色）。而正常非凋亡细胞及阴性对照胞核被苏木素复染呈蓝色。凋亡细胞分析：计数200倍视野下的凋亡细胞数及细胞总数，每组拍摄10个视野，计算凋亡细胞百分率(凋亡细胞/心肌细胞总数×100%)，重复5次。　　1.2.6caspase3活性测定　　按照caspase3活性试剂盒说明书进行操作。收集各组实验细胞,PBS清洗2次，2000r/min离心5min,去除PBS。沉淀细胞中加入50μl预冷裂解液和0.5μlDTT。吹打，冰上裂解60min，期间涡旋

8、4次，每次10s，4℃10000r／min离心1min，吸取上清至新管中置冰上，测蛋白浓度。各组应采用同样蛋白量进行实验，加入50μl的2×ReactionBuffer和0.5μlDTT，加入5μlcasp