重组腺病毒缺氧诱导因子-1α基因抗脑微血管内皮细胞缺氧的研究

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1、（《中国图书资料分类法》）单位代码：10660分类号R743.9学号：S090256贵阳医学院2012届硕士学位论文重组腺病毒缺氧诱导因子-1α基因抗脑微血管内皮细胞缺氧的研究研究生：晋明璐导师：陶陶教授年级：2009级专业：神经病学2012年5月6日贵阳医学院2012届硕士研究生学位论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„2-3前言„„„„„„„„„„„„„„4材料与方法„„„„„„„„„„„„5-19结果„„„„„„„„„„„„„„20-33讨论„„„„„„„„„„„„„„34-37参考文献„„„„„„„„„„„„„38-40小结„„„„„„„„„„„„„„„41实验附图„„„„„„„

2、„„„„„„42-50英文摘要„„„„„„„„„„„„„51-52致谢„„„„„„„„„„„„„„53缩略词表„„„„„„„„„„„„„54论文独创性声明„„„„„„„„„„55附：综述„„„„„„„„„„„56-60-1-贵阳医学院2012届硕士研究生学位论文重组腺病毒缺氧诱导因子-1α基因抗脑微血管内皮细胞缺氧的研究专业：神经病学研究生：晋明璐导师：陶陶教授摘要目的：探讨重组腺病毒缺氧诱导因子-1α（RecombinantadenovirusContainingHypoxia-inducibleFactor1αgene，AdHIF-1α）对大鼠脑皮质微血管内皮细胞（Brainmicro

3、vascularendothelialcells，BMEC）缺氧损伤的保护作用及其机制，为临床上应用基因治疗脑缺血奠定一定的理论基础。方法：体外培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞原代并传代，建立BMEC缺氧模型。实验分为四组即正常对照组，缺氧组，AdHIF-1α基因转染组和重组腺病毒空载体Ad转染组。采用下面的方法分别在大鼠脑皮质微血管内皮细胞缺氧24h后再观察12h,24h,48h,72h时间点各组HIF-1α，EPO（促红细胞生成素Erythropoietin），VEGF（血管内皮细胞生长因子VasculoarEndothelialGrowthFactor）的表达情况。其中包括：（1）倒置显

4、微镜观察正常BMEC和缺氧BMEC的细胞形态和生长情况。（2）在荧光显微镜下观察AdHIF-1α和Ad转染BMEC的情况。（3）逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测BMEC中HIF-1αmRNA,EPOmRNA,VEGFmRNA的表达。（4）免疫组化检测BMEC内HIF-1α，VEGF，EPO的蛋白表达变化。（5）蛋白质印迹法（WesternBlot）检测BMEC内HIF-1α，VEGF，EPO的蛋白表达水平。结果：（1）接种1天后可见大部分微血管段及单个细胞已经贴壁，微血管段边缘长出单个内皮细胞，呈三角形或长梭形，10-13天融合成片状，细胞排列紧密，互不重叠，呈典型的“铺路乱石样结构

5、”，即可传代。经Ⅷ因子相关抗原抗体免疫细胞化学染色鉴定，95%以上细胞的胞浆和核膜周围被染成棕褐色，证实培养的细胞为血管内皮细胞。（2）把第三代BMEC培养至第11天，换用含100umol/LCocl2的DMEM培养液继续培养12小时,24小时，48小时发现缺氧24小时实验模型最适合用于本实验。（3）AdHIF-lα/Ad转染BMEC后，12h开始出现少许荧光，48h荧光表达最明显，72小时可见荧光减弱。（4）经RT-PCR、免疫组化、WesternBlot分别检测得出Normal组（正常组）HIF-1α，EPO，VEGF就有基础表达，Hypoxia组（缺氧组）12h已开始明显上升，24h

6、有所升高，48h达高峰，72小时开始下降，并且各时-2-贵阳医学院2012届硕士研究生学位论文间点的表达量都比Normal组的高，两组相比有显著性差异（P<0.05,P<0.01）。AdHIF-1α基因治疗组各时间点的HIF-1α,EPO,VEGF的表达比其它组均明显增加,48小时达高峰，与Hypoxia组相比均有显著性差异（P<0.05,P<0.01）。Ad组与Hypoxia组相比无显著性差异。结论：本实验建立的脑皮质微血管内皮细胞培养模型及其缺氧模型的建立是成功的，可以作为脑缺血缺氧体外实验研究的对象；通过本实验可以得出AdHIF-1α对大鼠脑皮质微血管内皮细胞有保护作用。机制是外源性

7、HIF-1α促使其靶基因EPO及VEGF的表达上调，从而对脑缺血缺氧性损伤起保护作用。关键词：缺氧诱导因子-1α脑缺氧脑皮质微血管内皮细胞-3-贵阳医学院2012届硕士研究生学位论文前言脑血管疾病是严重威胁人类生命健康的常见病，多发病，传统的药物治疗及手术治疗都存在着一定的局限性，临床疗效也难以令人满意。脑缺血的基因治疗是颇具前景的治疗手段，以病毒为载体的基因治疗的有效性和安全性关系到最终治疗的成败。腺病毒是目前基因治疗